[发明专利]一种造血干细胞冻存液及造血干细胞冻存方法

说明书

技术领域

本发明涉及细胞生物学技术领域，具体涉及一种造血干细胞冻存液及造血干细胞冻存方法。

背景技术

造血干细胞是血液系统中的成体干细胞，是一个异质性的群体，具有长期自我更新的能力和分化成各类成熟血细胞的潜能。它是研究历史最长且最为深入的一类成体干细胞，对研究各类干细胞，包括肿瘤干细胞，具有重要指导意义。血液系统中的成熟细胞寿命极短，因此在人的一生中，造血干细胞需要根据机体的生理需求适时的补充血液系统各个成熟细胞组分。同时在损伤、炎症等应激状态下，造血干细胞也扮演着调节和维持体内血液系统各个细胞组分的生理平衡的角色。

造血干细胞在临床上应用极为广泛，造血干细胞冻存是保证造血干细胞移植成功的关键技术之一，故其冻存方式尤为重要。目前临床造血干细胞冻存有-196℃液氮程控降温保存和-80℃非程控降温保存，前者能长期保存且细胞损伤少，一般可保存23～25年，但操作复杂、设备昂贵，解冻后有细胞凝集现象，后者可保存干细胞1～2年，其操作相对简便、费用低，但保存细胞时间及细胞活性受限。

探索一种操作简便、快速、成本低廉及保存时间更长的干细胞冻存方法，对于临床造血干细胞的储存、应用及造血干细胞移植成功具有重要意义。在造血干细胞的冻存中，使用的冻存剂及方法均非常重要。目前应用于-80℃低温保存干细胞的保护剂有二甲基亚砜、CP-1、羟乙基淀粉、RPMI1640培养基、人血白蛋白等，不同的保护剂的配方及使用方法差异较大，对干细胞的保存效果与保存时间也存在差异，多数保存细胞的存活率为80％左右，干细胞安全难以保证，一些冻存方法还存在操作复杂缺点。

发明内容

为了克服现有技术中存在的缺点和不足，本发明的目的在于提供一种造血干细胞冻存液，该造血干细胞冻存液配方简单，原料便宜，能有效保护造血干细胞免受冷冻损伤，安全性高，对细胞的损伤小，可以提高造血干细胞的复苏成活率，复苏后的成活率可以达到96%以上，且复苏后细胞活率高、细胞增殖数量大、细胞不易老化，并保证了造血干细胞复苏后的生理功能和生物学特性，微生物检测指标符合要求，延长了造血干细胞的存活期。

本发明的目的在于提供一种造血干细胞冻存方法，该造血干细胞冻存方法可以有效解决造血干细胞无法存储、长时间运输的问题，实现了造血干细胞的本地采集、异地制备以及即时复苏的应用，为临床外周血造血干细胞的储存应用及造血干细胞移植提供可靠保证。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种造血干细胞冻存液，所述造血干细胞冻存液包括如下重量份的原料：

二甲基亚砜10-20mL

羟乙基淀粉6-10g

细胞培养基4-8mL

人血清白蛋白6-10mL

人自体血浆60-100mL。

所述二甲基亚砜为SIGMA型号为472301的二甲基亚砜。二甲基亚砜能提高细胞膜对水的通透性，降低溶液的冰点，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。

羟乙基淀粉是大分子非通透性细胞保护剂，可使细胞脱水，减少细胞内冰晶形成，对细胞膜具有保护作用。

本发明采用在造血干细胞冻存液中添加人血白蛋白作为细胞冻存稳定剂使用，有利于在冷冻复苏过程中调节渗透压，对细胞保护作用好，并且冻存液成本低，可进一步提高冻存细胞的存储稳定性，避免由于细胞存储供者血质问题导致过程储存活性不稳定或细胞复苏率下降。

本发明的造血干细胞冻存液通过采用二甲基亚砜、羟乙基淀粉及人血清白蛋白联合应用，可以有效地使干细胞冻存实现通透性保护作用，不仅降低冰点并延缓细胞冷冻过程，还增加干细胞的非通透性细胞保护作用，少细胞内冰晶形成，有效保护细胞膜，同时实现对干细胞的直接保护作用。

本发明的造血干细胞冻存液通过采用上述原料，并严格控制各原料的重量配比，制得的造血干细胞冻存液能有效保护造血干细胞免受冷冻损伤，安全性高，对细胞的损伤小，可以提高造血干细胞的复苏成活率，复苏后的成活率可以达到96%以上，且复苏后细胞活率高、细胞增殖数量大、细胞不易老化，并保证了造血干细胞复苏后的生理功能和生物学特性，微生物检测指标符合要求，延长了造血干细胞的存活期。

优选的，所述细胞培养基为X-VIVO15培养基、AIM-V培养基、DMEM/F12培养基、RPMI-1640培养基、GT-T551培养基、GT-T561培养基和Stemspan培养基中的任意一种。