[发明专利]一种高产莽草酸突变体的制备方法

说明书

本发明针对目前莽草酸产量无法实现高通量筛选的现状，提供了一种高产莽草酸的基因功能缺失大肠杆菌，其特征在于，基因sucC、或agp、或nanS、或pphB、或bglF、或promoter of sdhCDAB‑sucABCD operon、或gnd所表达的蛋白缺失功能；所述的基因sucC具有序列表中SEQ ID NO.1所述的碱基序列；所述的基因agp具有序列表中SEQ ID NO.2所述的碱基序列；所述的基因nanS具有序列表中SEQ ID NO.3所述的碱基序列；所述的基因pphB具有序列表中SEQ ID NO.4所述的碱基序列；所述的基因bglF具有序列表中SEQ ID NO.5所述的碱基序列；所述的基因promoter of sdhCDAB‑sucABCD operon具有序列表中SEQ ID NO.6所述的碱基序列；所述的基因gnd具有序列表中SEQ ID NO.7所述的氨基酸碱基序列。本发明实现了莽草酸产量的高产量。

技术领域

本发明涉及莽草酸筛选方法的技术领域。

背景技术

莽草酸(shikimic acid,SA)是合成芳香族氨基酸、生物碱及许多高附加值生物产品的重要中间体。近年来，禽流感疫情在全球范围内蔓延，莽草酸作为唯一有效预防和治疗禽流感药物磷酸奥司米韦(商品名“达菲”)的关键原料，因此备受关注。除此之外，莽草酸还可应用于合成抗肿瘤药物二恶霉素、乙二醛酶抑制剂。相较于传统的从诸如八角等植物果实中提取的方法和化学合成的方法，微生物发酵法生产莽草酸具有无可比拟的优势，如生产周期短、环境危害小、成本低等。其中，以经典工程菌株大肠杆菌作为宿主合成莽草酸为常用的微生物合成方式之一。

作为一种小分子化合物，尽管莽草酸有巨大的市场需求，但目前并无高产量的微生物发酵法生产莽草酸。

发明内容

本发明要解决的技术问题是针对目前莽草酸产量无法实现高产量现状。

首先，本发明提供了一种高产莽草酸的基因功能缺失大肠杆菌，基因sucC、或agp、或nanS、或pphB、或bglF、或promoter of sdhCDAB-sucABCD operon、或gnd所表达的蛋白缺失功能；

所述的基因sucC具有序列表中SEQ ID NO.1所述的碱基序列；

所述的基因agp具有序列表中SEQ ID NO.2所述的碱基序列；

所述的基因nanS具有序列表中SEQ ID NO.3所述的碱基序列；

所述的基因pphB具有序列表中SEQ ID NO.4所述的碱基序列；

所述的基因bglF具有序列表中SEQ ID NO.5所述的碱基序列；

所述的基因promoter of sdhCDAB-sucABCD operon具有序列表中SEQ ID NO.6所述的碱基序列；

所述的基因gnd具有序列表中SEQ ID NO.7所述的碱基序列。

其次，本发明还提供了一种生产莽草酸的方法：将paroG^fbr电转化于基因功能缺失大肠杆菌菌株DH5αΔaroA中，之后涂于卡纳霉素平板(50μg/ml)，将得到的菌种以0.01OD接种到LB培养基中，在250rpm、37℃条件下培养12h，利用HPLC检测发酵液中莽草酸产量。

进一步地，所述的paroG^fbr为：

具有序列表中SEQ ID NO.8所示的碱基序列或SEQ ID NO.28所示的氨基酸序列的蛋白质，或

具有序列表中SEQ ID NO.9所示的碱基序列或SEQ ID NO.29所示的氨基酸序列的蛋白质，或

具有序列表中SEQ ID NO.10所示的碱基序列或SEQ ID NO.30所示的氨基酸序列的蛋白质，或