[发明专利]诱导多能干细胞定向分化肾脏细胞的培养基和培养方法

说明书

本发明涉及细胞工程领域，尤其是涉及一种诱导多能干细胞定向分化肾脏细胞的培养基和培养方法。本发明诱导多能干细胞定向分化肾脏细胞的培养基包括DEME基础培养基10‑15g/L，甘露醇0.1‑0.5mM，肝素钠4‑8U，L‑谷氨酰胺1‑1.5mM，丙酮酸钠0.5‑0.85mM，β‑巯基乙醇0.15‑0.2mM，粘连蛋白1‑3mg/L，定向分化诱导因子27‑39ng/mL和血清替代物。本发明诱导多能干细胞定向分化肾脏细胞的培养基能有效促进诱导多能干细胞向肾脏细胞定向分化，且本发明培养基中无胎牛血清添加，避免了动物病原菌感染的风险。

技术领域

本发明涉及细胞工程领域，尤其是涉及一种诱导多能干细胞定向分化肾脏细胞的培养基和培养方法。

背景技术

慢性肾脏疾病是临床常见的多发病之一。据最新流行病学调查显示，目前我国慢性肾脏疾病患者高达1.2亿，患病率高达10.8％，且呈现逐年不断增长的趋势。肾脏移植术是临床最有效的治疗手段，但该技术存在供体短缺、同种异体排斥反应和终身服用免疫抑制剂等问题。因此，寻找到具有强大的再生能力且无排斥反应的种子细胞就成为了解决该问题的关键。目前用于再生医学研究的细胞主要有成体干细胞和胚胎干细胞，但这两种细胞均存在某些弊端，比如成体干细胞的数量和增殖能力有限；而胚胎干细胞的使用面临道德伦理争议问题。近年来，诱导性多能干细胞的出现为再生医学的研究提供了比较理想的种子细胞。

IPS细胞是用反转录病毒将多能性基因Sox2、Klf4、OCT4和c-Myc转染至体细胞，并使之重编程为能够无限增殖与分化的一类细胞，它与胚胎干细胞类似，体内外均能无限增殖，可分化为人体内几乎所有类型的细胞；同时，IPS具有取材简便、无免疫排斥反应、无道德伦理争议等优点，从而成为再生医学治疗研究中理想的种子细胞。但IPS细胞直接移植治疗存在致癌风险，必须在体外将其诱导为相对成熟的肾脏细胞才能用于移植治疗。

目前在再生研究领域中主要采用细胞因子进行定向诱导分化，研究发现生肾因子活化素A、骨形成蛋白7(bone morphogenetic protein-7，BMP7)、维甲酸(retinoic acid，RA)可以诱导鼠ES细胞向肾脏上皮细胞分化。利用Activin A、BMP4、血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growthfactor，VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(basicityfibroblast growth factor，b-FGF)等细胞因子诱导人ES细胞分化并得到一群早期的CD326^－CD56⁺细胞，而该群细胞可进一步分化为中胚层前体细胞。

黄佳卉等人在《体外诱导人iPS细胞向肾脏细胞定向分化的实验研究》中将经Dispase消化后的iPS细胞采用机械切割法传代，mTeSR培养液培养约3d至80％融合，进行实验分组：对照组(正常mTeSR培养组)和诱导组(诱导培养液中含有以下因子：10ng/mL的生肾因子活化素A、BMP7、hVEGF和b-FGF，0.1mol/LRA，10μmol/L lithium)，隔日换液。诱导组培养21d后加入1/2体积的肾脏上皮细胞培养液继续培养7d，同时观察细胞形态变化(上海交通大学学报(医学版)，2014，34(7):957-961.)。

目前，体外诱导人IPS细胞向肾脏细胞定向分化培养基，诱导率低，且培养基多含有胎牛血清，不能满足研究生产的大量需要。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种诱导多能干细胞定向分化肾脏细胞的培养基。本发明定向分化培养基，能有效促进IPS细胞向肾脏细胞定向分化，本发明诱导多能干细胞定向分化肾脏细胞的培养基能有效促进诱导多能干细胞向肾脏细胞定向分化，用本发明制备的定向分化培养培养得到的肾脏细胞中Bry、Pax2、AQP1和E-cad mRNA表达分别较未分化前的诱导多能干细胞均发生上调，其中Bry、Pax2、AQP1和E-cad mRNA可上调10、50、55和40倍，此外，本发明培养基中无胎牛血清添加，避免了动物病原菌感染的风险。