[发明专利]检测猪伪狂犬病毒野毒抗体的试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种检测猪伪狂犬病毒野毒抗体的试剂盒，其特征在于，包括以猪伪狂犬病病毒HB1201毒株为模板，利用上下游引物进行PCR扩增得到的重组蛋白；

所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系还包括：PCRBuffer、dNTPs、KOD酶和ddH20；

和/或，所述PCR扩增的反应条件为：94℃预变性2min；98℃变性10s，65℃退火30s，68℃延伸30s，35个循环；68℃延伸7min。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述重组蛋白的制备还包括：

将扩增后的产物纯化回收后，经EcoR I和Hind III双酶切，连接到相同双酶切的pET-32a表达载体中，转化得到重组质粒pET-32a-gE；

将重组质粒pET-32a-gE转化到感受态细胞BL21(DE3)中，用IPTG诱导重组蛋白表达，纯化，即得所述重组蛋白。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括包被液、封闭液、HRP标记山羊抗猪lgG抗体和化学发光底物。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，

所述包被液为pH为9-11、浓度为0.01-0.1mol/L的NaCO₃-NaHCO₃的缓冲液；

和/或，所述封闭液为0.5％-10％明胶、PBS、0.5％-10％马血清、0.5％-10％小牛血清、蔗糖混合液或0.5％-10％脱脂乳；

和/或，所述化学发光底物为Luminol和PIP。

6.使用权利要求1-5中任一项所述的试剂盒检测猪伪狂犬病毒野毒抗体的方法，其特征在于，包括：

(1)使用包被液和封闭液对所述重组蛋白进行处理；

(2)向步骤(1)处理后的液体中加入经稀释后的待检血清反应，再加入HRP标记山羊抗猪lgG抗体和化学发光底物，反应完成后，测定化学发光值RLU。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中：

使用包被液对重组蛋白进行处理包括：

用包被液将所述重组蛋白稀释至1-8μg/mL，优选为4μg/mL；

使用封闭液对所述重组蛋白进行处理包括：

向被包被液稀释后的重组蛋白中加入封闭剂，37℃下反应30min-2h；所述封闭剂为0.5％-10％明胶、PBS、0.5％-10％马血清、0.5％-10％小牛血清、蔗糖混合液或0.5％-10％脱脂乳。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中：

使用裂解剂对待检血清进行稀释，所述裂解剂为血清用PBS、PBST、10％-50％大肠杆菌裂解液上清中的一种或多种，优选为PBS+25％大肠杆菌裂液上清；

血清的稀释比例为1:100-1:3200，优选为1:200-1:800，进一步优选为1:400；

加入经稀释后的待检血清的反应条件为：37℃下反应20min-1h。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中：

加入HRP标记山羊抗猪lgG抗体的反应条件为：37℃下反应20min-1h，优选20min-40min。

10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中：

所述化学发光底物为0.1-0.8mmol/L Luminol和0.1-2mmol/L PIP的过氧化氢体系，优选为0.2-0.4mmol/L Luminol和0.5-1mmol/L PIP的过氧化氢体系，所述过氧化氢的浓度为0.1-4.0mmol/L，优选为0.5-1mmol/L；所述体系中pH值为7.5-9.0，优选为8.2-8.7；

加入化学发光底物的反应条件为：室温下反应3-15min，优选为5-10min。