[发明专利]一种用于扩增SMN1基因的PCR引物对和用于检测SMN1基因点突变的试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及遗传病基因检测领域，更具体地，涉及一种用于扩增SMN1 基因的PCR引物对和用于检测SMN1基因点突变的试剂盒。

背景技术

脊髓性肌萎缩(SMA)是一种遗传性神经肌肉遗传病，临床表现为进行性、对称性肢体近端和躯干肌肉无力、萎缩、呼吸衰竭，是发病率第二高的致死性常染色体隐性遗传病。目前尚无有效的治疗方法。SMA在活产婴儿中发病率约为1/6000～1/10 000，人群中的携带率为1/35～1/80，最新的报道称中国人群的携带率为1/42。SMA最主要的致病基因是运动神经元存活基因(SMN)，该基因突变导致脊髓前角细胞(脊髓运动神经元)退化、变性，使得患者肌肉日渐萎缩。SMN基因定位于5q13区，具有两个高度同源的基因拷贝：SMN1和SMN2。SMN1基因表达完整而稳定的SMN功能蛋白，是SMA的决定性基因，SMN1基因缺陷造成SMA表型；SMN2 基因与SMN1基因序列高度相似，仅存在5个碱基的差异，分别位于第7、 8外显子和第6、7内含子中，其中第7外显子上的C/T的差异，导致SMN2 在初级转录产物pre-mRNA剪切加工时发生外显子跳跃，产生的mRNA较 SMN1缺失第7外显子；研究表明，只有10％-15％的SMN2基因能表达为全长的SMN蛋白，因此也被成为SMA的补偿基因。已有统计表明，约95％的SMA患者为SMN1基因纯合缺失型(第7和/或第8外显子纯合缺失)，约5％为SMN1基因杂合缺失型(第7和/或第8外显子杂合缺失)与点突变形成复合杂合突变所致。

根据SMA的致病基因特点，现有的基因诊断技术主要是分析SMN1 基因第7外显子是否有缺失及缺失数目，不适合用于检测SMN1基因点突变(包括错义、无义、移码、剪切位点突变)。对于点突变的检测，由于SMN1 存在高度同源的SMN2基因且基因体长达32kb，常规的PCR-Sanger测序方法难以避免SMN2基因的干扰，给点突变的检测带来了极大的困难。目前通常采用的方法有两种：(1)通过提取总RNA，然后利用SMN1特异性引物反转录cDNA，再进行PCR-Sanger测序；(2)应用这两个基因在第8 外显子和第6内含子差异性位点，设计特异性引物，分析第7、8外显子的序列突变情况。这两种方法前期处理的工作量大，程序复杂耗费大量人力，成本高昂，效率低下；并且不能分析剪切位点突变，第二种方法只能检测第7、8外显子突变。

因此，本领域仍然需寻求一种新的检测SMN1基因点突变的方法，提高诊断准确率，简化操作流程，提高时效性。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于扩增SMN1基因的PCR引物对和用于检测SMN1基因点突变的试剂盒。利用本发明的SMN1特异性引物，首先特异性扩增SMN1超长片段，然后以长片段PCR产物为模板进行巢式PCR、对SMN1基因的全部外显子扩增，以实现对SMN1基因点突变的检测。

根据本发明，长片段PCR(Long Range-PCR，LR-PCR)是指扩增长度大于5kb的PCR，与常规的短片段PCR相比，最大的区别在于，其受DNA 模板的二级结构、引物的特异性和退火温度、以及不理想的循环条件等因素影响较大，以至于超长片段PCR的扩增难度较大。

为了保证扩增的特异性，只扩增SMN1真基因，设计引物时，首先比对SMN1基因和SMN2基因及上下游序列，寻找差异性位点；在该位点设计特异性扩增的上下游引物；为了进一步提高扩增的特异性，降低错配发生的概率，在差异性位点采用锁核酸(LNA)修饰核苷酸。

根据本发明的第一方面，本发明提供一种用于扩增SMN1基因的PCR 引物对，该PCR引物对包括具有SEQ ID NO：1所示碱基序列的引物和具有SEQ ID NO：2所示碱基序列的引物：

5'-GTGTTTAAGGATCTGCCGCCT-3'(SEQ ID NO：1)

5'-CGTGGCTGAGGCACGAGAACC-3'(SEQ ID NO：2)

其中，SEQ ID NO：1中位于3’端第2-4位的碱基、SEQ ID NO：2中位于5’端第6位和3’端第1位的碱基均为锁核酸修饰。

本领域技术人员公知，锁核酸(Locked Nucleic Acid，LNA)是一种寡核甘酸衍生物，和普通寡核甘酸分子区别在于其结构中含有一个或多个 2’-O，4’-C-亚甲基-β-D-呋喃核糖核甘酸单体，核糖的2’-O位和4’-C位通过亚甲基桥连接起来，成环形。