[发明专利]将消化道来源上皮细胞重编程为内胚层干/祖细胞的方法及应用

权利要求书

1.将消化道来源上皮细胞重编程为内胚层干/祖细胞的方法，包括以下步骤：

1)将原代分离的消化道来源上皮细胞作为起始细胞，扩增培养所述消化道来源上皮细胞；

2)用丝裂霉素-C处理滋养层细胞后清洗，并用酶消化细胞后备用；

3)将步骤2)准备的滋养层细胞添加于步骤1)扩增培养的消化道来源上皮细胞中，继续共培养过夜；

4)第2天更换为重编程培养基，每2-3天换一次培养基，培养7-15天，得到诱导内胚层干/祖细胞克隆；

步骤4)中所述重编程培养基为小分子化合物组合与基础培养基和细胞培养基础添加成分的混合物；其中所述小分子化合物组合为FBP、简称为Bay的Bay K 8644、简称为Bix的Bix01294、简称为SB的SB431542、VPA、简称为RG的RG108、PD0325901和PS48，或为Bay K8644、Bix01294、简称为A83的A83-01、VPA、RG108、PD0325901和PS48的化合物组合，统称为8M组合，或为Bix01294、Bay K 8644、RG108和SB431542的化合物组合，简称BBRS组合，或为A83-01、Bay K 8644、RG108和Bix01294的化合物组合，简称BBRA组合。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中的起始细胞为消化道来源上皮细胞，包括胃上皮细胞和十二指肠上皮细胞，起始细胞用Kubota培养基在37摄氏度，5％CO₂培养箱条件下培养5天。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述胃上皮细胞为NCAM阳性的胃上皮细胞。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中的滋养层细胞为消化道来源的基质细胞，包括胃肌成纤维细胞或小肠肌成纤维细胞。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述滋养层细胞为人胃肌成纤维细胞；用丝裂霉素-C处理人胃肌成纤维细胞2-3小时，用PBS清洗细胞，用TrypLE酶消化细胞。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤3)按1～3×10⁵每平方厘米的密度将步骤2)准备的滋养层细胞添加于步骤1)培养到5天的消化道来源上皮细胞中，在37℃、5％CO₂培养箱中过夜或12-16小时。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于：所述8M组合为SB43154：VPA：PD0325901：RG108：Bix01294：Bay K 8644：PS48：FBP按摩尔比为50：12500：12.5：1:12.5：50:125：87500的组合；或A83：VPA：PD0325901：RG108：Bix01294：Bay K 8644：PS48：FBP按摩尔比为12.5：12500：12.5：1:12.5：50:125：87500的组合，且按该配比的8M组合在使用中满足RG使用浓度为0.01～1μM。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：在使用中满足RG使用浓度为0.04μM。

9.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于：所述BBRS组合和BBRA组合中各化合物使用浓度为：SB43152为1～10μM，A83为0.4～1μM，RG108为0.01～1μM，Bix01294为0.1～2μM，Bay K 8644为1～4μM。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：BBRS组合为各化合物按SB：RG：Bix：Bay摩尔比50:1:12.5:50的组合，BBRA组合为各化合物按A83：RG：Bix：Bay摩尔比12.5:1:12.5:50的组合。