[发明专利]一种兔正常角膜上皮细胞及其用途

说明书

技术领域

本发明属于细胞生物学领域，涉及一种兔正常角膜上皮细胞及其原代分离培养和传代培养方法与用途。

背景技术

现代医学是建立在动物实验的基础上发展而来。无论是疫苗研发，器官移植、生理学、药理学、毒理学的研究，还是化妆品的开发，都是伴随实验动物的牺牲而来。如果取消动物实验，现代医学的发展将停滞不前，人类将不可能战胜疾病。目前，国际上对于动物实验公认的一个原则就是“替代、减少、优化”。首先，研究人员要尽量寻求动物活体实验的替代方案，例如，利用计算机动态仿真及细胞组织培养等离体技术。其中，细胞组织培养是目前应用最广泛的替代方法，特异性分化的上皮细胞与不同器官的特异性功能直接相关，如肺的气体交换功能、肾的过滤功能、肝的解毒及中和功能、胰腺细胞产生胰岛素、皮肤具有保护机体免受外界环境的伤害。目前，分离来自哺乳动物的原代上皮细胞的体外培养仍然是很困难的。应用目前的无血清培养基，有的只能进行短期的原代培养（存活数天，如肺和胰腺等上皮细胞），有的只能进行有限的传代培养，有的甚至根本不能体外培养（如肝、结肠、前列腺等上皮细胞），只有来自于人体皮肤的角化上皮细胞可以传代培养10代左右。而且从每个动物或活体组织样品中获得的上皮细胞产量仍然很低，包括细胞的数量、直接分离或短期培养的细胞纯度都是很低的，这些原代和传代上皮细胞的增殖速度也极为有限。这种只能短期培养的细胞并不能真正意义上替代动物实验。

为了在体外进行上皮细胞的培养，目前国外尝试通过遗传操作，如转入病毒（SV40 T或HPV16E6E7）或细胞癌基因，可以延长体外细胞存活的代数。然而遗传操作的最大缺点是会改变这些细胞的遗传背景和表型，以致让这些正常上皮细胞丢失其正常生理功能，如 p53 和pRB信号通路常常被抑制。而且，这些经遗传修饰的细胞是不可能重新再移植进机体的。但是由于目前缺乏有效的体外培养上皮细胞的技术，上述这些细胞在当今世界的医学和生命科学研究中仍然备受青睐。在非癌症研究领域，它们就代表着最初来源的“功能”性的组织或器官。现阶段，国内外还从未有过“正常细胞”可以应用于基础和临床医学研究。

兔正常角膜上皮细胞主要功能：（1）角膜表面的上皮细胞构成了非角化的复层上皮。（2）组成物理屏障，可有效防止多种物理和化学损伤。（3）产生和分泌化学介质和细胞因子形成高度复杂的宿主防御系统。角膜上皮细胞与主要病理生理疾病有关，如角膜损伤、病毒性角膜炎。目前，国际上没有应用于体外药物药敏与毒性检测的兔角膜上皮细胞模型，已有的研究也只是在原代兔角膜上皮细胞的基础上开展实验，不能传代和扩增，因此就无法避免重复地进行实验动物创伤性地组织分离甚至处死实验动物。如果能获得体外稳定传代的兔正常角膜上皮细胞，并建立体外兔角膜3D模型，将有希望取代角膜相关药物临床与基础研究的活体动物实验，建立一种新的研究角膜药物药理与毒理的替代方法。

发明内容

为了解决现有技术存在的不足，本发明公开了一种兔正常角膜上皮细胞，并建立体外兔角膜3D模型，将有希望取代角膜相关药物临床与基础研究的活体动物实验，建立一种新的研究角膜药物药理与毒理的替代方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明的第一方面，提供一种兔正常角膜上皮细胞，命名为兔正常角膜上皮细胞RNCEC/HL-032，拉丁文为：Rabbit Normal Corneal Epithelial Cells RNCEC/HL-032，已于2016年10月18日保藏于中国典型培养物保藏中心（地址：中国. 武汉. 武汉大学），保藏编号为CCTCC NO:C201677；该细胞是分离培养自新西兰兔的正常角膜缘组织的正常角膜上皮细胞。

所述的兔正常角膜上皮细胞的培养条件优选为用HL培养基于37℃、5% CO₂培养；所述的HL培养基为：DMEM与无血清培养基SFM按体积比1 : 3混合，同时添加5%（v/v）的FBS（胎牛血清），以及0.4 μg/mL皮质醇（hydrocortisone），5 μg/mL胰岛素（insulin），8.4 ng/mL霍乱毒素（cholera toxin），10 ng/mL表皮生长因子（epithelial growth factor (EGF)），24 μg/mL腺嘌呤（adenine），100 U/mL青霉素（penicillin），100 μg/mL链霉素（streptomycin），0.25 µg/mL两性霉素B（Fungizone），30 μM法舒地尔（Fasudil），上述培养基需经0.22μm孔径滤膜过滤。

上述兔正常角膜上皮细胞的原代分离培养方法，包括如下步骤：