[发明专利]DNA片段与含有该片段的重组载体、构建重组载体的方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及DNA片段与含有该片段的重组载体、构建重组载体的方法及其应用。

背景技术

急性白血病是一种比较常见的血液系统恶性肿瘤，是人类致死的主要原因之一。近年来，随着联合化疗和造血干细胞移植技术的发展，使得白血病及其它血液系统肿瘤的预后不断改善，然而由于肿瘤的微小残留病变(MRD)不能被彻底清除，疾病复发率及死亡率较高。

研究发现，核酸疫苗能够激发白血病患者特异性免疫应答，清除化疗后残余肿瘤细胞，是有望克服MRD的方法之一。Padua等将人类早幼粒细胞白血病的PML-RARα融合基因与破伤风毒素基因的C片段序列融合，证实以融合蛋白为特异性靶点的核酸疫苗可以显著提高患病动物的生存率。MLAA-34基因是与急性单核细胞白血病(AML-M5)发生密切相关的一个新的抗凋亡分子，MLAA-34基因表达下调能显著抑制U937细胞在体外的增值，同时会诱发白血病细胞的凋亡，并与AML-M5的低生存率等不良预后密切相关，是急性白血病的新肿瘤标志物及基因免疫治疗的靶基因。MLAA-34蛋白是胞内蛋白，如何有效递呈MLAA-34蛋白至白血病细胞膜表面从而持续诱导机体产生特异性细胞免疫并成为效应细胞毒性T细胞(CTL)的靶向分子，是疫苗能否发挥抗白血病作用的关键。HSP70与肿瘤的发生、发展、肿瘤免疫和肿瘤的预后等都有密切关系，其具有抗原递呈功能，能将肿瘤细胞内的抗原信息传递至细胞膜上，进而诱导机体产生特异性抗肿瘤免疫应答，且其诱导的免疫应答可不受MHC限制，可以起到很好的抗肿瘤免疫效应，从而起到杀灭肿瘤细胞的作用。

此外，关于核酸疫苗能否整合到宿主基因组上的安全性问题一直备受关注。研究表明，免疫方式对DNA疫苗的整合安全性有很大影响，电穿孔免疫方式会导致基因组整合现象，而肌肉注射和基因枪(gene gun)免疫方式较为安全，核酸疫苗的质粒DNA是以染色体外附加子的形式存在，而不是整合到宿主染色体DNA上。

发明内容

本发明的发明目的之一是提供一组DNA片段。

本发明的发明目的之二是提供包括上述DNA片段的重组载体。

本发明的发明目的之三是提供构建上述重组载体的方法。

本发明的发明目的之四是提供通过上述重组载体进行基因疫苗的制备。

本发明提供的技术方案为：

DNA片段，由序列表中的SEQ ID NO.1所示的碱基序列组成。

含有外源多核苷酸的重组载体，包含原始载体以及HSP70-MLAA34融合基因；

其中，所述融合基因包含序列表中的SEQ ID NO.1所示的碱基序列组成的DNA片段。

优选的是，所述原始载体为pIRES2-EGFP质粒。

构建含有外源多核苷酸的重组载体的方法，包括：

步骤一、利用序列表中的SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的引物序列通过PCR扩增得到含有SEQ ID NO.4所示的碱基序列的HSP-70基因；

利用序列表中的SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的引物序列通过PCR扩增得到含有SEQ ID NO.7所示的碱基序列的MLAA-34基因；

步骤二、以HSP-70基因和MLAA-34基因为模板，利用序列表中的SEQ ID NO.2和序列表中的SEQ ID NO.6所示的引物序列，通过SOE-PCR扩增得到序列表中的SEQ ID NO.1所示的HSP70-MLAA34融合基因，并且使其含有EcoRI和BamHI酶切位点；

步骤三、将步骤二所述的HSP70-MLAA34融合基因构建到原始载体上以得到重组载体。

优选的是，所述原始载体为pIRES2-EGFP质粒。

优选的是，包括如权利要求3所述的重组载体以及U937细胞。

优选的是，其转染方法包括如下：

取U937细胞进行培养并收集对数生长期的细胞进行接种，另取两份培养基，在其中一份培养基中加入转染试剂，在另一份中加入含有HSP70-MLAA34融合基因的重组载体，将两份培养基混合均匀，将混合均匀后的转染复合物加入到细胞中，混合均匀，将细胞置于37℃、5％CO₂的培养箱中培养18～48小时；其中，转染4～6小时后可换新鲜培养基。

优选的是，所述转染细胞进行转染方法包括如下：