[发明专利]一种多基因组装载体系统及其多基因组装方法

说明书

本发明公开了一种多基因组装载体系统及其多基因组装方法。该系统包括1类接受载体、2类供给载体、以及可选择使用的能发生筛选标记自删除的供给质粒。该系统利用Cre/loxP重组系统和两组突变型loxP的不可逆重组位点，在Cre酶作用下，以野生型loxP位点的重组来实现供给载体整合到接受载体中，然后其一组突变型loxP的不可逆重组自动删除供给载体的骨架，只留下目的基因在接受载体上；重复2类供给载体交替与接受载体的组装，就能实现多基因的快速组装。本发明是目前最简单高效的多基因载体系统。因此本发明对重要的、复杂生物合成途径和重要农艺性状的多基因遗传工程操作提供了可操作的技术平台，具有重要的应用价值。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种多基因组装载体系统及其多基因组装方法。

背景技术

植物(作物)中重要的性状如很多农艺性状、复杂代谢合成途径、重要信号传导途径、重要功能的蛋白复合体等都涉及到了多个基因的共同作用，受多基因控制，其基因工程操作常常需要用到多基因转化叠加技术(TransGeneStacking,TGS)。而常规的转基因技术手段只能完成少数(通常1-3个)基因的操作。“黄金大米”和“紫番茄”是目前成功报道的多基因转化作物的两个成功案例，但它们也仅仅是用了2个基因。因此，多基因组装与转化技术是目前基因工程研究的热点与难点，具有重要的应用前景。

与多质粒混合后基因枪共转或单基因分别转化后再杂交聚合的方法相比，在同一植物表达载体上组装多个基因再转化植物的方法是更直接、简单和高效的。但多基因表达载体的构建是其限制因素。传统的酶切连接方法，受到酶切位点的限制，很难完成多个基因在一个表达载体上的构建。为此，目前已有几种多基因组装的方法，包括基于稀有内切酶和归巢内切酶建立pRCS/pAUX和pSAT载体系统(Goderis et al.,2000；Tzfira et al.,2005；Dafny-Yelin et al.,2007)，基于Cre/loxP和归巢内切酶建立的多基因载体系统(Lin etal.,2003；ZL02134869.3)，基于Gateway技术建立的多位点或多轮载体系统(Chen et al.,2006)，以及采用Cre/loxP、Gateway和细菌交配辅助转移的复杂方法的MISSA系统(Chen etal.,2010)。但是，上述方法在进行多基因组装中使用仍然比较困难、费时费力、效率不高。如MISSA多基因系统，需要使用两种Cre/loxP和Gateway两个重组系统，和细菌交配辅助转移的复杂方法实现带供给载体和接受载体的两种菌株间的基因转移与融合，比较繁琐复杂；而Cre/loxP和归巢内切酶建立的多基因载体系统(Lin et al.,2003；ZL02134869.3)则简单得多，该系统用Cre/loxP重组整合供给载体质粒到接受载体上，再用切割效率较低的归巢酶切去供给载体骨架，用双链DNA接头连接入载体，但这也使得整个操作在连接多个基因是比较困难，效率较低。因此，简单高效的多基因载体系统的开发，对多基因工程和合成生物学的应用十分必要。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种高效的多基因组装载体系统。

本发明的另一目的在于提供所述的多基因组装载体系统的应用。

本发明的再一目的在于提供一种多基因组装方法，是对上述多基因组装载体系统的具体应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种多基因组装载体系统，命名为TGSII，包括1类接受载体、2类供给载体、以及可选择使用的能发生筛选标记自删除的供给质粒；2类供给载体分别命名为供给载体I和供给载体II；接受载体具有loxP/I-Sce I/loxP1R核心元件DNA序列；供给载体I具有loxP/PI-Sce I/loxP2R/MCS/loxP1L/I-Sce I核心元件DNA序列；供给载体II具有loxP/I-Sce I/loxP1R/MCS/loxP2L/PI-Sce I核心元件DNA序列。供给载体I的MCS序列与供给载体II的MCS序列相同或不相同。