[发明专利]一种新型米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶的生产方法及其应用

说明书

本发明公开了一种新型米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶的生产方法及其应用，具体涉及重组天冬氨酸蛋白酶、编码基因及其生产方法和应用。该重组天冬氨酸蛋白酶是由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的蛋白质，所述重组天冬氨酸蛋白酶的编码基因是SEQ ID NO：2所示的DNA分子。将米黑根毛霉的天冬氨酸蛋白酶基因RmproA连接至巴斯德毕赤酵母GS115表达载体pPIC9K，并转化至毕赤酵母中诱导表达得到重组天冬氨酸蛋白酶。经5L发酵罐高密度发酵后，重组菌株在156h时最高产蛋白酶活力为3400U/mL，蛋白含量为6.42mg/mL。本发明提供的重组天冬氨酸蛋白酶能有效嫩化猪肉，降低剪切力，使肉质适口，能够有效水解动物及植物蛋白，制备低分子量多肽。

技术领域

本发明涉及一种新型米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶的生产方法及其应用。

背景技术

蛋白酶(Protease，EC 3.4)是一类催化蛋白质水解生成多肽和氨基酸的酶，在生物体中发挥着不同的生理功能。蛋白酶来源丰富，广泛存在于动植物及微生物中。通过天然筛选和基因工程等手段获得的蛋白酶具有不同的特性，已应用于食品、制革、饲料和洗涤等多个领域。

天冬氨酸蛋白酶是具有重要工业应用价值的一类蛋白酶，在奶酪制造、调味料生产、酪蛋白水解物制备、肉类嫩化及多肽制备等中都有应用。大多数天冬氨酸蛋白酶在酸性pH条件下表现出较高活性，又被称为酸性蛋白酶。已报道的产酸性蛋白酶的菌株主要有曲霉属的黑曲霉、米曲霉和泡盛曲霉等。根毛霉属和毛霉属也是产酸性蛋白酶的优良菌株，已被广泛应用于商业凝乳酶制剂的制备。目前，国内研究较多的是米黑毛霉所产的凝乳酶，经紫外诱变后的米黑毛霉所产的凝乳酶活力达到2703 SU/mL(李学朋,关明玲,冯瑞章等.产凝乳酶米黑毛霉的诱变育种研究.食品工业科技,2015,36:137-141)。李学朋等人优化了米黑毛霉产凝乳酶的固体发酵条件，产酶活力最高达3649 SU/mL(李学朋,师希雄,冯瑞章等.米黑毛霉产凝乳酶固体发酵培养基优化.食品工业科技,2014,7:130-134)。此外，米黑毛霉一个天冬氨酸蛋白酶基因已在卷枝毛霉中成功表达(Dickinson L.,Harboe M.,Heeswijck R.V.,Stroman P.,Jepsen L.P.Expression of active Mucor mieheiaspartic protease in Mucor circinelloides.Carlsberg Research Communicaions,1987,52,243-252)。有专利报道利用米黑毛霉生产凝乳酶方法(专利号为201310472404.6，申请日期2013.10.11)，采用米黑毛霉ATCC16457发酵产凝乳酶，添加硫酸盐和还原糖发酵时酶活力最高为410IMCU/mL。