[发明专利]一种基因递送系统

说明书

技术领域

本发明涉及由亲脂的异喹啉-3-羧酸和亲水的RGDV序列肽结合形成的新型两亲性脂质体载体的制备，以及IRV/STAT3-siRNA基因递送系统的构建，并且对其进行了体内外抗肿瘤活性和基因沉默效率的评价。本专利主要是通过异喹啉结构增强抗肿瘤活性，结合RGDV序列肽增强脂质体的靶向性，使其在靶部位的浓度增加，从而减小副作用，提高了治疗指数。

背景技术

基因治疗是指将发挥治疗作用的基因通过一定方式导入靶细胞，以纠正基因缺陷或者沉默相关基因表达，从而起到抗肿瘤的目的。STAT基因即信号转导子与转录激活子，是一类新型的由细胞因子、生长因子等多肽类配体激活的细胞内信号传递和基因表达调控因子家族。其中STAT3是这个家族重要的组成，广泛参与了多种细胞因子的应答反应。研究发现，对大多数成人的正常细胞、组织来说STAT3并不是必须的，但是活化的STAT3对肿瘤细胞的形成、生长、凋亡等过程却起着重要的调控作用，在肿瘤转移中是起重要作用的媒介。同时STAT3的异常激活也会导致下游基因的活化，包括VEGF和survivin基因。

RNA干扰技术是通过小干扰RNA造成目的mRNA特异性降解,从而使基因转录后沉默的一种手段。利用STAT3siRNA阻断STAT3基因的特异性表达已成为重要的抗癌研究。然而裸siRNA在体内容易被RNase酶降解，半衰期短，转染效率低，这些缺点限制了siRNA的活性，因而能够稳定包裹siRNA到达并转入癌细胞的载体十分必要。

利用合成的两亲性的异喹啉-3-酰基-RGDV替代磷脂，与胆固醇结合形成空白脂质体。再利用脂质体-多聚阳离子-DNA复合物技术，带正电荷的鱼精蛋白可以吸附siRNA及小牛胸腺DNA，形成一个稳定的带负电的复合物，并能最大限度压缩siRNA，此复合物再与阳离子脂质体复合形成脂质体/siRNA复合物，形成一种新型siRNA递送系统，提高了基因的转染效率。其中异喹啉是已被证明具有抗血栓抗肿瘤等活性的结构，RGD是能够与肿瘤细胞中整合素受体特异性结合的序列肽，因此该载体还具有靶向性和一定的抗肿瘤活性。

RGDV是一种含“精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸”氨基酸序列的多肽，可识别肿瘤细胞表面特异表达的整合素，并与其特异性结合从而来介导肿瘤的靶向治疗。经过RGDV序列肽修饰的抗肿瘤药物及其递送系统,可增加药物的主动靶向性,从而达到特异性治疗的目的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有靶向性的基因脂质体载体:Isoquinoline-3-acyl-RGDV。

本发明所述的基因脂质体载体的制备方法，包括以下步骤：将化学合成得到IQ-COOH，与RGDV缩合即得。

本发明的另一个目的在于提供一种基因递送系统，由抗肿瘤基因治疗药物STAT3-siRNA，和权利要求1所述的基因脂质体载体Isoquinoline-3-acyl-RGDV制备而成。

本发明所述的基因递送系统中，抗肿瘤基因治疗药物STAT3-siRNA(100nM)和基因脂质体载体Isoquinoline-3-acyl-RGDV(100％)的用量比为1:1.1(μL:μL)。

本发明所述的基因递送系统，纳米结构。

本发明的另一个目的在于提供基因递送系统的制备方法。

本发明所述的制备方法，包括以下步骤：基因脂质体载体Isoquinoline-3-acyl-RGDV与鱼精蛋白室温下混合，静置，备用，取小牛胸腺DNA与抗肿瘤基因治疗药物STAT3-siRNA室温下混合，静置备用，将上述两种溶液混合后，即得基因递送系统。

其中，基因脂质体载体的制备：

IRV的合成：苯丙氨酸和甲醛在HCl的催化下发生PS缩合反应得到四氢异喹啉羧酸，经过甲酯化再氧化后脱甲酯得到异喹啉-3-羧酸。IQ-COOH与H-Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl在THF中通过DCC/HOBt反应，再脱掉保护基团形成Isoquinoline-3-acyl-RGDV(IRV)。

优选的，本发明所述的基因脂质体载体的制备：

在HCl的催化下，5g苯丙氨酸与甲醛在80～90℃油浴下发生PS反应，缩合生成四氢异喹啉羧酸(4H IQ-COOH)；将4H IQ-COOH在SOCl2的催化下，与甲醇发生酯化反应，得到4H IQ-OMe；以THF作溶剂，用高锰酸钾催化氧化4H IQ-OMe为IQ-OMe；以甲醇为溶剂，在2N NaOH的催化下，IQ-OMe脱去甲酯，得到IQ-COOH。