[发明专利]一种基于CRISPR/Cas9技术制备水稻OsPIL15突变体的方法及应用

权利要求书

1.一种基于CRISPR/Cas9技术制备水稻OsPIL15突变体的方法，其特征在于：包括如下步骤：

1)gRNA靶点序列的选择：序列为5′-GACTTCTTCTCCGAGCTCCAGG-3′，所述序列3′端的PAM序列为AGG，限制性内切酶SacⅠ识别序列为5′-GAGCTC-3′；

2)gRNA寡核苷酸链上下游引物的设计：

上游引物为sgRNA-F：5′-GGCGGACTTCTTCTCCGAGCTCC-3′，

下游引物为sgRNA-R：5′-AAACGGAGCTCGGAGAAGAAGTC-3′；

3)gRNA表达载体构建：将所述上下游引物混合、退火，得寡核苷酸双链DNA；用内切酶BsaⅠ酶切pBUN411质粒，得线性质粒；用T4连接酶将所述线性质粒和寡核苷酸双链DNA连接，得连接产物；将连接产物转化、筛选、验证，即得pBUN411-gRNA表达载体；

4)将pBUN411-gRNA表达载体导入农杆菌中，得CRISPR/Cas9-gRNA农杆菌；用CRISPR/Cas9-gRNA农杆菌侵染水稻愈伤组织；

5)将步骤4)获得的愈伤组织诱导得到再生苗，筛选得到转基因阳性植株，鉴定即得水稻OsPIL15突变体。

2.根据权利要求1所述的制备水稻OsPIL15突变体的方法，其特征在于：步骤3)中所述退火为在65℃退火5min。

3.根据权利要求1所述的制备水稻OsPIL15突变体的方法，其特征在于：步骤5)为在除草剂的条件下筛选得到再生苗。

4.根据权利要求3所述的制备水稻OsPIL15突变体的方法，其特征在于：步骤5)为采用抗除草剂基因引物进行筛选；

所用引物为：Bar-F：5′-AAGCACGGTCAACTTCCGTA-3′；

Bar-R：5′-GAAGTCCAGCTGCCAGAAAC-3′。

5.根据权利要求1所述的制备水稻OsPIL15突变体的方法，其特征在于：步骤5)为采用gRNA靶点序列两侧引物进行鉴定；

两侧引物为OsPIL15-test-F：5′-TGTTTTGTGTGTGCAGGTCC-3′；

OsPIL15-test-R：5′-CGGGAGAAGAGCGAGAAGTT-3′。

6.根据权利要求5所述的制备水稻OsPIL15突变体的方法，其特征在于：所述鉴定包括：

A：以转基因阳性植株DNA为模板，OsPIL15-test-F和OsPIL15-test-R为检测引物，进行PCR扩增；

B：用SacⅠ酶酶切PCR扩增产物；

C：用电泳分离酶切产物，若电泳结果仅为400bp和273bp两条带，为未突变株；否则，为突变株。

7.根据权利要求6所述的制备水稻OsPIL15突变体的方法，其特征在于：将所述转基因阳性植株的PCR扩增产物测序，确定是杂合体、双等位突变体、纯合突变体或未发生突变单株。

8.根据权利要求1所述制备水稻OsPIL15突变体的方法的应用，其特征在于：所述水稻OsPIL15突变体在水稻育种中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：选择所述水稻OsPIL15突变体的自交后代中的纯合突变体用于水稻种子粒长育种。