[发明专利]一种基于时间分辨荧光免疫分析技术和异源性抗体的罗非鱼生长激素定量检测试剂盒

说明书

本发明公开了一种基于时间分辨荧光免疫分析技术和异源性抗体的罗非鱼生长激素定量检测试剂盒。该试剂盒包括：包被了斜带石斑鱼生长激素特异性单链单克隆抗体的微孔反应板，重组罗非鱼生长激素蛋白标准品，铕标记的斜带石斑鱼生长激素特异性单链单克隆抗体。通过包被抗体夹心法的免疫反应，向包被了斜带石斑鱼生长激素特异性单链单克隆抗体的微孔反应板中加入重组罗非鱼生长激素蛋白标准品或待测样品，孵育结合后洗板，再加入铕标记的斜带石斑鱼生长激素特异性单链单克隆抗体，孵育结合后洗板，最后加入增强液并通过多功能酶标仪测定。本发明可以检测罗非鱼血清或垂体裂解液等含有生长激素的样品中的生长激素浓度，检测灵敏度可达到0.225ng/mL，为罗非鱼生长激素的研究提供了有效的检测手段。

技术领域

本发明涉及生物分析化学、纳米生物技术领域，具体地，涉及一种基于时间分辨荧光免疫分析技术和异源性抗体的罗非鱼生长激素定量检测试剂盒。

背景技术

罗非鱼属于鲈形目（Perciformes），丽鱼科（Cichlidae），罗非鱼属（Tilapia），原产于非洲，具有杂食性，生长快，繁殖力高，适应性强的特点，是世界性的主要水产养殖对象之一，被誉为未来动物性蛋白质的主要来源之一。罗非鱼的生长主要通过生长激素（Growthhormon，GH）调节。鱼类GH为不含糖基的蛋白质，由垂体远端的嗜酸性细胞合成分泌，为一级结构中含有两个二硫键的单链。同一目鱼类中，GH氨基酸组成同源性约为80%。罗非鱼生长激素的cDNA全长为615 bp，编码204个氨基酸，成熟肽含有187个氨基酸。鱼类GH参与营养物质的能量代谢，在鱼类生长、繁殖及渗透压调节等方面起到重要作用。

罗非鱼与石斑鱼同属于鲈形目，经NCBI Blast比对，两者的GH成熟肽氨基酸序列（CAA00818.1和AAO13496.1）相似度达到90%。

检测罗非鱼GH大多采用放射免疫分析、酶免疫分析、Western blot等方法，但放射免疫分析会造成放射性污染，且试剂盒保存时间短。酶联免疫分析为定性或半定量方法。Western blot操作繁琐，耗时长，通量小。

时间分辨荧光免疫分析技术（TRFIA）是继放射免疫后标记物发展起来的一种技术，已成为生物医学研究和临床生化检验中一项重要的分析手段。TRFIA利用镧系荧光配合物作为荧光标记物标记配体或受体，发生免疫反应后，根据时间分辨荧光仪测到的最后产物中的荧光强度和相对荧光强度的比值，推测反应体系中分析物的浓度，达到定量分析的目的。利用镧系稀土离子荧光寿命长的特点，在每个激发光脉冲过后，通过时间延缓期，让短寿命的荧光衰变掉后，再记录稀土螯合物的荧光强度，几乎可以完全消除背景荧光的干扰，提高灵敏度。TRFIA具有操作简便、储存时间长、无放射性污染、试剂盒稳定性好、检测不受样品本底荧光干扰、标准曲线范围宽、应用范围广等优点。非常适合定量要求高，重复性好、需批量处理的检测样品。

目前TRFIA技术已广泛应用于多种临床检测项目中，但运用该技术检测罗非鱼GH尚无文献报道。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的上述不足，提供一种基于时间分辨荧光免疫分析技术和异源性抗体的罗非鱼生长激素定量检测试剂盒。该试剂盒可用于定量测定罗非鱼血清、组织细胞裂解液或细胞孵育液等溶液中的罗非鱼生长激素的含量。

为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

一种基于时间分辨荧光免疫分析技术和异源性抗体的罗非鱼生长激素定量检测试剂盒，所述试剂盒包括包被了斜带石斑鱼生长激素特异性单链单克隆抗体的微孔反应板，重组罗非鱼生长激素蛋白标准品，铕标记的斜带石斑鱼生长激素特异性单链单克隆抗体；所述斜带石斑鱼生长激素特异性单链单克隆抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。