[发明专利]一种微量核酸释放剂、制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种微量核酸释放剂、制备方法及其应用。

背景技术

自1985年PCR技术问世以来，这一技术已被广泛应用到生命科学各个领域，其特点是敏感性高、特异性强、操作简便、所需时间短等。由于临床或直接获得标本中含有蛋白质、脂类等可干扰PCR反应的物质，故在做PCR反应前必须进行核酸提取与纯化。PCR检测技术的第一步就是模板DNA/RNA的制备，这直接影响后续PCR反应的结果。一直以来，样本中核酸的提取和纯化是整个实验中最耗时，最繁琐的过程，严重影响样本检测的速度。

样本中核酸的提取主要包括两个步骤：裂解细胞和提取核酸。裂解细胞使核酸从细胞中释放，蛋白解离的常用方法包括物理法(煮沸、冻融、微波、超声、研磨等)、化学方法(高盐、表面活性剂、苯酚等)和酶消化法(溶菌酶、蛋白酶K等)。

苯酚-氯仿抽提法、异丙醇沉淀法及甲酰胺裂解法是提取DNA最为经典的方法，目前很多方法的改进都是在这些方法的基础上进行的，这三种方法均是利用蛋白酶K和十二烷基硫酸钠(SDS)消化裂解细胞。在前两种方法中，裂解液先用苯酚-氯仿去除蛋白质，再分别用乙醇或异丙醇双醇沉淀DNA。甲酰胺法是利用高浓度的甲酰胺解聚蛋白质与DNA的结合，然后利用透析来处理DNA样品。这些经典方法在不计样本量情况下获得的DNA纯度很高，能够满足各种试验的要求，但操作繁琐，用时长，且所用试剂具有一定的毒性。

碱裂解法是在NaOH提供的高pH(12.0～12.6)条件下，用强阳离子去垢剂SDS破坏细胞壁，裂解细胞，与NaOH共同使细胞的蛋白质发生变性，释放出DNA。裂解后，细胞壁碎片与变性的蛋白质和其他杂质形成大的复合物，这些复合物在高钾盐条件下，可有效沉淀，而DNA保留于上清液中，再通过无水乙醇沉淀、乙醇洗涤等步骤纯化DNA。碱裂解法虽然快速简便，但去蛋白效果欠佳，明显影响了后续PCR效果。

煮沸裂解法原理，是在煮沸时将样品中的DNA通过含蛋白酶K等裂解缓冲液的作用释放出来，溶解在缓冲液中，沸水浴裂解细胞的同时，可破坏DNA链的碱基配对，并使细胞的蛋白质与染色体DNA变性。通过离心沉淀去除变性的蛋白质和其他杂质，然后回收上清液中的DNA用于PCR扩增。然而，经高温煮沸，蛋白凝固使部分核酸被包裹并随离心沉淀丢失，直接导致上清液中模板核酸量减少；另外，虽经煮沸并高速沉淀，上清液中仍含有少量抑制扩增的成分如蛋白、肝素及微量血红蛋白等，抑制了扩增效率。

磁珠法是近几年才发展起来的核酸提取方法，磁珠法提取核酸是通过细胞裂解液裂解细胞，从细胞中游离出来的核酸分子被特异的吸附到磁性颗粒表面，而蛋白质等杂质不被吸附而留在溶液中。反应一定时间之后，再在磁场作用下，使磁性颗粒与液体分开，回收颗粒(即磁珠-DNA混合物)，再用洗脱液洗脱，得到纯净的DNA。由于其系列试剂不含氯仿、苯酚等毒性大的有机溶剂，提取步骤更简单，对核酸样本的回收率高和纯度好等优势而倍受研究者青睐。不过产品基本上为国外所垄断，价格非常昂贵，从而限制了其在我国的广泛应用。

目前，国内外临床应用于荧光定量PCR扩增核酸提取方法主要有：(1)碱裂解煮沸法，在样本中加入裂解液煮沸提取核酸；(2)硅胶膜吸附柱法，采用硅胶膜层析柱吸附、清洗、洗脱获得核酸；(3)磁珠吸附法，采用磁珠吸附、清洗、洗脱获得核酸。这三种方法都需要经过多步骤离心(或负压抽吸、磁棒分离)、换管或移液操作才能获得核酸，存在操作步骤繁多、过程中核酸容易丢失或污染的不足。

因此由于临床上样本的量比较少，例如临床样本包括血液、唾液、擦拭物等，无法通过常规核酸提取方法得到符合要求的核酸，影响后续的核酸检测结果，因此迫切需要一种可以进行微量核酸释放的试剂，既可以灵敏地进行核酸的检测，又免去核酸的回收步骤，避免核酸丢失或污染。

发明内容

针对上述技术问题，本发明的目的提供了一种微量核酸释放剂，其中，所述核酸释放剂的各组分配比为：体积百分比0.2％～2.5％的表面活性剂、质量体积百分比0.5％～8％的氯化钾、质量体积浓度0.02mg/ml～1.5mg/ml的蛋白酶K、质量体积百分比0.5％～10％的牛血清白蛋白和2mg/ml～50mg/ml氢氧化钠，余量为水。

其中表面活性剂Tween-20(聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯；吐温-20)。

本发明是在经典碱裂解煮沸法的基础上，加入多项试剂优化而来的。经典碱裂解法可以释放大部分液体样本DNA，但有诸多缺点：

1、裂解不够充分，如果低于1000拷贝/毫升DNA，样本无法得以有效裂解。