[发明专利]microRNA检测探针及石墨烯检测方法

说明书

本发明公开一种microRNA石墨烯检测方法，（1）、H1/H2‑GO复合物的构建：将荧光标记的发夹探针H1与H2分别在95℃下孵化5min；将探针缓慢冷却至室温并孵化1h以上；最后，将GO与发夹探针一同加入到1×SPSC缓冲溶液当中，室温下孵化0.5h，形成稳定的H1/H2‑GO复合物；（2）、在含有H1/H2‑GO复合物的1×SPSC缓冲溶液体系中，首先加入靶目标miRNAs，然后加入RecQE以及ATP，避光条件下37℃，孵化50min；最后，测量系统HCR产物的荧光信号强度。本发明方法比无酶HCR/GO传感平台的检测灵敏度高出两个数量级，是目前化学发光检测方法中灵敏度最高的检测手段，具有重要的潜在应用价值。

技术领域

本发明属于肿瘤检测技术领域，具体为一种microRNA检测探针及石墨烯检测方法。

背景技术

癌症是全球一个主要死亡原因，中国首当其冲，中国新诊断癌症病例为307万，占全球总数的21.8%。癌症死亡人数约220万，占到全球癌症死亡人数的26.9%。MicroRNA是基因表达的重要调节器。肿瘤发生时，microRNA调节致癌与肿瘤抑制途径。MicroRNA不仅和癌症的发生有关，而且能够为相关癌症的治疗提供新的工具和希望。

let-7家族是目前研究最为广泛的一类miRNA，也是肿瘤抑制因子。let-7通过靶向多种原癌基因、细胞周期及细胞增殖过程中的关键因子来发挥调控作用，在肿瘤的诊断和预后判断中起重要作用，与肺癌关系尤为密切。在正常组织中，let-7随着细胞的分化而表达水平升高，其靶向的原癌基因如HMGA2和RAS等则表达下调。肺癌中let-7表达时常降低，且let-7所在染色体区域也常缺失，而其靶基因表达却升高。因此可以通过检测细胞内let-7的含量来预测细胞的癌变程度。

石墨烯是一种新型的纳米材料，其内部结构非常独特，它具有六角晶格的结构，每两个碳原子构成一个元胞，每个碳原子与邻近的原子可以构成3个σ键和一个π键。石墨烯表面具有超强的吸附能力，利用此性能，石墨烯可以吸附染料分子（或者荧光基团标记的生物分子），发生高效的能量转移，导致染料分子的荧光信号碎灭。由于石墨烯这一独特性能，可以将其应用于生物分子的检测领域。

发明内容

let-7家族是目前研究最为广泛的一类miRNA，在正常的细胞中，let-7家族正常表达；而大多数肿瘤细胞中，let-7表达下调，因此可以通过检测细胞内let-7的含量来预测细胞的癌变程度。本发明利用氧化石墨烯对DNA单双链的吸附性能不一样，设计let-7的荧光探针，并创造性的引入解旋酶和ATP，使得本发明的检测方法比同类型的检测方法，在灵敏度上提高20%，可以快速、准确的检测出let-7的含量，对肿瘤的早期检测有一定的实际意义。

本发明目的是提供一种高效、灵敏的microRNA检测方法，该方法应用了杂交链式反应（HCR）信号放大和氧化石墨烯（GO）表面固定的检测手段。

本发明是采用如下技术方案实现的：

本发明的技术方案之一为，microRNA检测探针，Cy3荧光标记的茎环结构的DNA探针设计为

H1：AGTAGCAAGTATAGTTCAAAGTAACTATACAACCTACTACCTCA-Cy3；

H2：Cy3-ACTTTGAACTATACTTGCTACTTGAGGTAGTAGGTTGTATAGTT。

本发明的技术方案之二为，microRNA石墨烯检测方法，将解旋酶和ATP引入杂交链式反应的miRNA检测体系中，构建增强型HCR反应体系，其中Cy3荧光标记的茎环结构的DNA探针设计为

H1：AGTAGCAAGTATAGTTCAAAGTAACTATACAACCTACTACCTCA-Cy3；

H2：Cy3-ACTTTGAACTATACTTGCTACTTGAGGTAGTAGGTTGTATAGTT；