[发明专利]经干扰序列修饰的TGF-β1缄默的白血病细胞外泌体及其制备方法和应用

权利要求书

1.经干扰序列修饰的TGF-β1缄默的白血病细胞外泌体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一，白血病细胞的培养；

步骤二，制备干扰序列TGF-β1-sh3修饰的白血病细胞；

步骤三，外泌体的抽提与纯化；

步骤四，经修饰后的白血病细胞外泌体靶向致敏的树突状细胞疫苗作为保护性肿瘤疫苗的抗白血病效应检测；

步骤五，经修饰后的白血病细胞外泌体靶向致敏的树突状细胞疫苗在荷瘤小鼠中的效应检测；

其中，所述外泌体是由经干扰序列修饰的TGF-β1缄默的白血病细胞分泌的，所述干扰序列为shRNA3，所述shRNA3的序列如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示。

2.根据权利要求1所述的经干扰序列修饰的TGF-β1缄默的白血病细胞外泌体的制备方法，其特征在于，步骤一具体为：

a)配置好含有10％胎牛血清的1640完全培养基，所述培养基内含100U/ml青霉素钠和100ug/ml硫酸链霉素，将冻有L1210细胞的冻存管从液氮罐中取出后直接投入37℃温水中，并轻轻摇动使其尽快融化，取出冻存管，用酒精消毒后开启，用吸管吸出细胞悬液，转移到15ml尖底离心管，并滴加10倍以上的培养液，离心1200rpm×10min，弃上清，新鲜的完全培养液重悬后接种至培养瓶；

b)培养瓶置于37℃、5％CO2培养箱内孵育，细胞呈悬浮生长，每1－2d换液或传代。

3.根据权利要求1所述的经干扰序列修饰的TGF-β1缄默的白血病细胞外泌体的制备方法，其特征在于，步骤二为：构建含有干扰序列基因的TGF-β1RNA干扰慢病毒，用得到的慢病毒转染白血病细胞，得到经干扰序列修饰的白血病细胞。

4.根据权利要求3所述的经干扰序列修饰的TGF-β1缄默的白血病细胞外泌体的制备方法，其特征在于，步骤二具体步骤为：

a)根据Genebank中TGF-β1核苷酸序列及siRNA设计shRNA3靶点序列，同时合成与TGF-β1基因序列无关的siRNA作为阴性对照，序列经同源分析后，合成含有干扰序列的双链DNAOligo，其两端含有酶切位点粘段，连入酶切后的pHBLV-U6-Scramble-Zsgreen表达载体上，将连接好的质粒转入大肠杆菌DH5a，挑选阳性重组菌落进行PCR鉴定及测序比对后，鉴定为阳性克隆，即构建成功TGF-β1RNA干扰慢病毒载体；

b)构建好的慢病毒穿梭质粒与其慢病毒包装载体质粒pSPAX2、pMD2G分别进行高纯度无内毒素抽提，然后共转染293T细胞，转染6小时后，更换为完全培养基，培养48小时及72小时后，收集富含慢病毒颗粒的细胞培养上清，对其浓缩后获得高滴度的慢病毒浓缩液；

c)取对数期白血病细胞，接种于24孔板中，每孔细胞数10⁵个，每组设3复孔，每组以感染复数(multiplicity of infection，MOI)值100分别加入携带有shRNA3和作为阴性对照的shRNA(shRNA NC)的慢病毒，每孔感染复数(MOI)值均为100，加入polybrane 8ug/ml充分混匀后，室温下，2000g离心90分钟，离心后置于5％CO₂，37℃细胞培养箱中，24小时后，更换完全培养基，转染72小时后，分选出各组中GFP阳性细胞，得到经干扰序列修饰的白血病细胞；将携带有shRNA3的慢病毒的白细胞病细胞命名为L1210_TGF-β1，将感染了阴性对照的shRNA3慢病毒的白血病细胞命名为L1210_GFP。