[发明专利]双特异性磷酸酶在人重组FGF21蛋白活性检测中的应用

说明书

技术领域

本发明属于双特异性磷酸酶(DUSP4)应用技术领域，具体涉及一种双特异性磷酸酶在人重组FGF21蛋白活性检测中的应用。

背景技术

2型糖尿病严重威胁人类健康，其新药研制一直是科研和开发领域的热点，尤其以蛋白类药物开发更为引人注目。在众多的候选蛋白中，成纤维细胞生长因子21(FGF21)是一个研发热点。研究发现，FGF21重组蛋白可降低肥胖和2型糖尿病患者的血脂、减轻体重、降低血糖、显著减轻2型糖尿病及其并发症。在药物研发中，建立一个稳定高效的药物效果检测体系是评价候选药物的关键，因此，建立一个客观评价FGF21重组蛋白治疗糖尿病效果的检测体系也是FGF21研发中的一个重要环节。

目前，普遍采用的FGF21活性检测方法是细胞的葡萄糖摄取测定：该方法通过葡萄糖的类似物2-脱氧葡萄糖来测定，2-脱氧葡萄糖摄入细胞后被己糖激酶磷酸化为6-磷酸-2-脱氧葡萄糖，6-磷酸-2-脱氧葡萄糖无法进入后续代谢步骤，因而会在细胞中聚集，直接成比例地反映细胞的葡萄糖摄入水平：该方法检测过程中一是使用放射性物质标记2-脱氧葡萄糖，对于实验防护和环境保护要求较高；另外检测方法中使用荧光检测方法测定6-磷酸-2-脱氧葡萄糖的水平，该方法价格昂贵，不利于高通量筛选使用，同时该检测还受到己糖激酶活性的影响，在酶活性发生变化时不能很好地反映葡萄糖摄取能力变化。因此，研发新的FGF21功能检测的体系不仅可弥补葡萄糖摄取测定的不足，而且有望获得更为简便可靠的检测方法，这对于客观评价FGF21重组蛋白效果具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种双特异性磷酸酶在人重组FGF21蛋白活性检测中的应用，为判断人重组FGF21蛋白活性提供了新的思路，解决了现有检测方法成本昂贵、对环境要求高的问题。

本发明所采用的技术方案是，双特异性磷酸酶在人重组FGF21蛋白活性检测中的应用。

本发明的特征在于，

双特异性磷酸酶的基因表达水平与人重组FGF21蛋白的添加浓度的关系为：双特异性磷酸酶基因表达水平随人重组FGF21蛋白的添加浓度的增加而增大。

本发明所采用的另一个技术方案是，用于判断人重组FGF21蛋白活性的双特异性磷酸酶，其特征在于，所述的双特异性磷酸酶的引物序列为：

上游引物：5’-CCT GCT TAA AGG TGG CTA TGA GA-3’；

下游引物：5’-AGT ACT TGC GCT CAG GAG GA-3’。

本发明的特征还在于，

双特异性磷酸酶表达被人重组FGF21蛋白上调，且呈剂量依赖性升高。

双特异性磷酸酶为脂肪细胞内的双特异性磷酸酶。

本发明的有益效果是：本发明通过人重组FGF21蛋白处理脂肪细胞，采用定量反转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测脂肪细胞的基因表达，从而确定脂肪细胞双特异性磷酸酶表达水平可成为FGF21活性检测的新指标，操作过程简单，对环境的要求低，有很好的实用价值。

附图说明

图1是本发明细胞转变为成熟脂肪细胞的显微图片；

图2是本发明定量PCR观察DUSP4和beta-actin基因的扩增曲线图；

图3是本发明PCR产物的溶解曲线；

图4是本发明人重组FGF21对DUSP4基因表达的影响图；

图5是本发明人重组FGF21对DUSP4基因表达的的量效关系图；

图6是本发明人重组FGF21受体抑制剂对FGF21作用的抑制效应图。

具体实施方式

本发明基于脂肪细胞DUSP4基因表达的人重组FGF21蛋白活性检测方法，下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。