[发明专利]钙网蛋白基因1型突变检测用封闭PNA探针

说明书

本发明公开了一种钙网蛋白基因1型突变检测用封闭PNA探针；该肽核酸封闭探针为CALR‑1PNA：AAGAAGACAAGAAACG‑KK，经验证，该序列可以大幅提高CALR基因1型突变检测体系的特异性。

技术领域

本发明涉及钙网蛋白基因1型突变检测领域，具体涉及一种钙网蛋白基因(CALR基因)1型突变检测用封闭PNA探针。

背景技术

骨髓增殖性肿瘤(MPN)是骨髓中一种或多种髓系细胞增殖和外周血中成熟及不成熟细胞增加的克隆性造血干/祖细胞疾病。近年来，多个分子标志物，如JAK2、MPL和TET突变等相继被发现，这些标志物的发现对于理解MPN的分子发病机制具有重要意义，也有助于对这类疾病的患者进行诊断和治疗。但是，有30％～45％的携有野生型JAK2/MPL的原发性血小板增多症(ET)或原发性骨髓纤维化(PMF)患者仍然存在诊断困难，新近报道的钙网蛋白基因(CALR)突变将能部分填补这一空白，有望成为诊断骨髓增殖性肿瘤又一种新的分子标志物。

CALR是一种主要位于内质网的有多重功能的钙离子结合和储存蛋白分子伴侣，通过协助蛋白质正确折叠和维持细胞钙离子稳态而参与调节细胞增殖、凋亡、黏附、免疫等过程。CALR基因定位于染色体19p13.2，它有9个外显子和9个蛋白结构域，CALR基因突变是由第九外显子插入和缺失引起，导致一个碱基对的读码框移位，继而产生一种具有缺乏内质网保留序列(KDEL氨基酸序列)的新型的C-羧基末端的蛋白，到目前为止，已经检测到多于40种不同的CALR突变体，其中最常见的两种变异体分别为：由52个碱基缺失引起的1型变异体(p.L367fs*46)和由5个碱基TTGTC插入引起的2型变异体(p.K385fs*47)，它们分别占所有突变体的53％和32％，研究者在体外实验中发现，过度表达的1型突变体增强了白介素-3表达，也促进了STAT5磷酸化作用并且引起信号传导的激活，这种激活作用能被JAK抑制剂阻滞，这说明CALR和JAK2突变可能有类似的机制。

当前CALR基因1型突变的检测主要依赖于探针实时PCR法或测序法等，然而，由于CALR基因1型变异所在的区段碱基重复序列多、GA含量高，导致所设计出的检测体系特异性差，检测效果不够理想。肽核酸(Peptide Nucleic Acid，PNA)是近十几年发展起来的以中性酰胺键为骨架的脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic Acid，DNA)类似物，它能够与DNA和RNA特异性地结合从而可以制备PNA探针，与DNA探针相比，其杂交的稳定性和特异性增加且能在低盐浓度下进行杂交，因此它能够大大提高检测的效率和灵敏度，PNA独特的生化属性已逐渐为世人所瞩目.PNA探针技术也得到了迅速发展。

发明内容

本发明的目的在于针对上述现有技术存在的不足，提供一种钙网蛋白基因1型突变检测用封闭PNA探针。具体而言，本发明针对CALR基因1型突变进行特异性检测的PCR体系设计了一段肽核酸序列，作为封闭探针，用于对扩增体系中的非特异性核酸序列(即非1型突变的核酸序列)进行封闭，可以大大提高PCR检测的特异性(实时PCR或环介导等温扩增法等)。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明涉及一种CALR基因1型突变检测用PNA探针，所述PNA探针包含SEQ ID NO.1所示的序列。

优选的，所述PNA探针的序列为AAGAAGACAAGAAACG-KK。(16nt，末端加2个赖氨酸，增加亲水性)

本发明还涉及一种CALR基因1型突变检测用引物，所述引物用于扩增CALR基因1型突变靶序列；包括如SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5所示的引物对，以及如SEQ ID NO.6，SEQ IDNO.7所示的引物对。所述CALR基因1型突变检测是引入本发明的包含SEQ ID NO.1所示的序列的PNA探针进行的突变检测。

优选的，所述CALR基因1型突变靶序列如SEQ ID NO.3所示。