[发明专利]一种土元抗菌肽分离及抗菌活性研究方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种土元抗菌肽分离及抗菌活性研究方法。

背景技术

抗菌肽是一类免疫效应因子,它在机体的先天非特异性免疫中起重要作用，构成了低等动物机体快速有效的免疫机制。抗菌肽最初从昆虫中发现,随后在各种其它动物乃至植物中也发现了抗菌肽，其家族不断扩大，种类不断增多。抗菌肽的研究始于二十世纪70年代中叶，此后一直是生命科学研究的热点之一。利用基因工程方法生产抗菌肽除了工艺等问题外，还由于抗菌肽种类单一而效果欠佳，从来源丰富的天然材料中纯化抗菌肽很有应用前景。

土元Eupolyphaga sinensis Walker，蜚蠊目Blattaria地鳖科Polyphagidae昆虫，是我国传统的药用昆虫，具有活血祛瘀、通经止痛、抗肿瘤等功效，对白血病细胞具有抑制作用。土元喜欢生活在黑暗、潮湿的环境中，而且在人工规模高密度饲养条件下很难集体染病，因此可能是很好的天然抗菌药物来源。但目前还没有完善的土元抗菌肽的分离及抗菌活性分析研究方法。

发明内容

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种土元抗菌肽分离及抗菌活性研究方法，以解决现有技术的不足。

为实现上述目的，本发明提供了一种土元抗菌肽分离及抗菌活性研究方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、供试菌株制备，菌株采用番茄灰霉病病菌，首先将长有灰色霉层的番茄病果实表面用无菌水冲洗，于病变交界处切取3mm×3mm的方块，然后置于PDA平板培养基上于25℃培养箱中培养；于发病严重果实上挑取灰色霉层少量，置于PDA平板培养基上，于25℃培养箱中培养；将25℃下分离培养1-2天后的病原菌挑取单菌丝，纯化2-3次后，转接于PDA斜面培养基中于4℃冰箱中保存备用；

步骤二、土元抗菌肽粗提液的提取制备，200g干土元用水浸泡30min，洗净沥干，沸水浸泡10min，迅速用自来水冲凉、沥干；加入4℃预冷的0.5mol/L乙酸溶液800mL匀浆，匀浆液于4℃条件下，搅拌提取液，提取液在4℃、15000r/min条件下离心40min，将上清液冷冻干燥，获得粗提物干物质放置于-80℃低温冰箱中备用；

步骤三、抗菌活力的测定，根据有效成份含量，分别配制成PDA平板，每处理5个重复；步骤一制备的供试菌株在PDA平板上25±1℃暗培养3天，用内径为4.5mm的打孔器打取菌塞备用，随机取一菌塞，反接于加药的PDA平板上，以不加药的PDA做对照，25±1℃暗培养，24h、48h后各测定1次菌落直径；

步骤四、根据步骤三，结合药剂的相对抑制率A＝(B－C)/B×100％，评价供土元抗菌肽粗提物对番茄灰霉病菌的抑制作用，其中A为相对抑制率，B为对照菌落平均直径，C为处理组菌落的平均直径。

上述的一种土元抗菌肽分离及抗菌活性研究方法，其特征在于：所述步骤一将长有灰色霉层的番茄病果实表面用无菌水冲洗3次。

上述的一种土元抗菌肽分离及抗菌活性研究方法，其特征在于：所述步骤三的PDA平板的抗菌肽粗提物质量浓度分别为1.0、2.0和3.0mg/L。

本发明的有益效果是：

本发明通过简易的实验方法，得出土元抗菌肽粗提物对番茄灰霉病菌具有较明显的抑制作用，方法较为完善、可靠，参考数据准确，有效解决了现有技术的不足。

具体实施方式

一种土元抗菌肽分离及抗菌活性研究方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、供试菌株制备，菌株采用番茄灰霉病病菌，首先将长有灰色霉层的番茄病果实表面用无菌水冲洗，于病变交界处切取3mm×3mm的方块，然后置于PDA平板培养基上于25℃培养箱中培养；于发病严重果实上挑取灰色霉层少量，置于PDA平板培养基上，于25℃培养箱中培养；将25℃下分离培养1-2天后的病原菌挑取单菌丝，纯化2-3次后，转接于PDA斜面培养基中于4℃冰箱中保存备用；

步骤二、土元抗菌肽粗提液的提取制备，200g干土元用水浸泡30min，洗净沥干，沸水浸泡10min，迅速用自来水冲凉、沥干；加入4℃预冷的0.5mol/L乙酸溶液800mL匀浆，匀浆液于4℃条件下，搅拌提取液，提取液在4℃、15000r/min条件下离心40min，将上清液冷冻干燥，获得粗提物干物质放置于-80℃低温冰箱中备用；