[发明专利]基于FRET辨别DNA碱基长度及检测单链DNA结合蛋白的生物传感方法

说明书

本发明公开了基于荧光共振能量转移(FRET)辨别DNA碱基长度并检测单链DNA结合蛋白(SSB)的荧光传感方法，具体步骤如下：(1)阳离子共轭聚合物(CCP)与铱配合物混合，然后加入PBS缓冲溶液，得到用于检测SSB的基于CCP与铱配合物FRET效应的荧光传感器体系。检测荧光强度，计算CCP(415nm)的荧光强度与铱配合物(530nm)的荧光强度比值；(2)加入不同长度的DNA或发卡DNA到步骤(1)中的体系，检测荧光强度的变化；(3)不同浓度的SSB加入到步骤(2)中，然后加入缓冲溶液，检测荧光强度的变化，获得一系列不同浓度的SSB对应的荧光强度比值，建立荧光强度比值I₅₃₀/I₄₁₅与SSB浓度之间的定量关系；根据定量关系可以辨别DNA碱基长度并检测样品中SSB的未知浓度。

技术领域

本发明涉及荧光生物传感器，一种基于荧光共振能量转移(FRET)辨别DNA碱基长度并检测单链DNA结合蛋白(SSB)的荧光传感方法。

背景技术

DNA是生命的物质基础，编码着自然界千变万化的遗传现象，贮存着生物界无穷无尽的遗传信息。众所周知，DNA分子由A、T、C、G四种核苷酸经3’，5’-磷酸二酯键相连构成DNA的基本骨架，并组成遗传指令，以引导生物发育与生命机能运作。其中包含的指令，与病原基因和遗传疾病、基因表达调控、细胞增殖分化和调亡及癌症的发生、发展存在着重要的联系。如果它在结构上稍有所改变、缺失或增多，就可能会引起遗传信息的改变或各种疾病的出现。目前，简单的静电作用不能容易地区分单链DNA、双链DNA或是DNA的长度。因此，发明一种无标记、容易区分单链DNA、双链DNA或是DNA长度的分析传感方法对相关疾病的预前预后检测具有十分重要的意义。

蛋白和DNA之间的作用在很多生物过程中起着非常重要的作用，例如：DNA的复制、转录、重组以及修复等生命活动。单链DNA结合蛋白(single-stranded DNA bindingprotein，SSB)是所有活细胞中一种很关键的蛋白，能够与大量的蛋白发生作用，引导其他蛋白在DNA复制、修复等过程中发挥作用。SSB是化学或酶降解过程中重要的蛋白类，能够保护单链DNA(single-stranded DNA，ssDNA)。SSB可与ssDNA结合，在DNA的新陈代谢过程起到保护ssDNA的作用，使ssDNA在细胞中短暂地稳定存在。而在自然界存在许多不同类型的SSB，大肠杆菌中的SSB是比较典型的一种，单体的分子量大约为19kDa，通常以四聚体的形式存在。SSB包含两个功能性结构域，分别是：位于N端的结合ssDNA的寡核苷酸/寡聚糖结合结构域和位于C端的结构域。N端结构域与碱基堆积的共同作用下可与ssDNA的磷酸骨架结合；而C末端含有一条由6个高度保守的氨基酸残基组成的富含天冬氨酸的无序结构域，具有结合DNA复制、同源重组和损伤修复有关蛋白的能力。它能够与各种形式的ssDNA结合，对ssDNA的碱基序列没有特殊要求，可稳定折叠ssDNA构象，但不能与双链DNA发生作用。SSB与ssDNA的结合是通过四个亚基与ssDNA缠绕，紧密结合在一起。

目前，对SSB的研究只限于其与DNA的结合方式，而用于检测SSB的方法却很少，主要有电化学发光法(ECL)、电化学法等；尽管以上方法各有优点，但仍存在一些不足之处，如：电化学发光测试方式复杂；电化学方法的稳定性不好、重复性差等。因此，开发一种灵敏、简便、快速的新型分析技术，实现对低浓度SSB的检测，是迫切需求的。

荧光法具有灵敏度高、动态范围广、操作简单等优点，具有很大的发展潜力，在分析传感器方面得到广泛的应用，目前应用荧光法检测SSB的报道较少，具有较大的发展空间。

铱配合物具有发光效率高、较大的Stokes位移、发光颜色可以通过改变配体结构进行调节以及良好的光稳定性等优点而成为研究的热点。根据报道，铱配合物在生物传感器方面的应用越来越广泛。阳离子共轭聚合物(CCP)作为一种新型的水溶性荧光分子，具有摩尔吸光系数大、荧光量子产率高等优点。同时，共轭聚合物具有分子导线的功能，能够实现荧光信号的放大。目前基于铱配合物和CCP荧光共振能量转移(FRET)现象检测SSB的荧光传感器尚未见报道。