[发明专利]多形汉逊酵母重组菌株及其在甘油生物合成中的应用

说明书

本发明提供一种多形汉逊酵母重组菌株及其在甘油生物合成中的应用，主要是运用低能离子注入技术介导酵母基因组总DNA转化酵母菌的方法构建能够耐高盐的甘油高产重组菌株。本发明提供的重组菌株通过底物分批补料进行生物转化生产甘油，其甘油产量和底物葡萄糖的转化率在发酵中分别可达到97.29g/L和83.27％。

技术领域

本发明属于离子束介导转基因领域，具体涉及利用低能离子注入介导酵母基因组总DNA转化酵母菌的方法构建耐高盐重组酵母菌株及其在甘油生物合成中的应用。

背景技术

甘油(Glycerin)，又称丙三醇、三羟基丙烷，分子式为C₃H₈O₃，相对密度1.26，熔点17.8℃，沸点290.0℃。甘油是一种无色或微黄色透明粘稠液体，无毒、无臭、无腐蚀性，具有较强的吸湿性。甘油作为重要的有机化工原料，广泛用于军工、食品、医药、日用化工等行业。我国甘油生产能力约为8.6-9万吨，其中皂化法生产能力为6万吨，化学合成法生产能力为1.5-1.8万吨，好氧发酵法生产能力超过1万吨。由于化学合成甘油的原料价格昂贵，以此为基础的合成洗涤剂的发展也受到了限制，这制约了肥皂工业的发展。因此人们将目光集中到发酵法生产甘油。

Nicherson和Carroll在1945年第一次提出可以用耐高渗酵母生产甘油。这主要由于甘油可以对渗透压进行调节，并且它可以在细胞内部积聚，可以起到平衡外界渗透压的作用，进而保护细胞不受到渗透压作用而破裂，因而可以通过选择耐高渗的酵母菌株进行甘油发酵。范光先等人通过研究发现，高浓度的盐能引起耐高渗酵母碳源代谢途径由HMP途径向EMP途径转换，致使甘油产量增加。

低能离子注入为冷加工过程，伴随多种物理与化学反应。通过控制低能注入离子剂量，可直接将裸露DNA大分子转入受体细胞，而且细胞定位注入及单离子束定点注入在对临近靶物质的基团或者细胞不产生伤害的情况下能够引起靶物质发生显著的生物学变化，具有明显的优越性和新颖性。同时，低能离子注入对生物体的诱变表现出损伤轻、突变范围广、多发性及局部性等优点，并且已被大量的研究结果证实。

赵德志等利用低能离子注入介导酵母基因组总DNA转化酵母菌的方法，获得了一株甘油高产酵母工程菌，但是，甘油产量和底物利用率仍有待提高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种多形汉逊酵母重组菌株及其在甘油生物合成中的应用。

一种多形汉逊酵母重组菌株，该重组菌株的分类命名为多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)，所述重组菌株的保藏编号为CGMCC No.14015。

所述重组菌株(CGMCC No.14015)的获得方法，包括以下步骤：

1)运用低能离子注入介导酵母基因组DNA转化多形汉逊酵母出发菌株；

2)重组菌株初筛：将经低能离子注入介导酵母基因组DNA转化后的出发菌株用高盐固体培养基进行初步筛选；

3)将初步筛选得到的重组酵母菌株进一步进行液体发酵培养，利用纸色谱法和气相色谱法分析发酵所得发酵液，从而对重组酵母菌株进一步筛选鉴定。

所述出发菌株为多形汉逊酵母H.polymorpha DL-1(来源为ATCC No.26012)。

所述酵母基因组DNA提取自多形汉逊酵母H.polymorpha DL-1(来源为ATCCNo.26012)。

所述低能离子注入的条件为：注入离子为N⁺，注入剂量为1.5×10¹⁶～2.5×10¹⁶ions/cm²，注入能量为15～25KeV，脉冲时间为5～10s，间隔时间为5～10s，真空度为1.5～2.0×10^-4Pa。