[发明专利]一种低温保存猪精液的抗氧化稀释液制备方法

说明书

技术领域

本发明属于饲养业的工艺技术领域，具体涉及到一种低温保存猪精液的抗氧化稀释液制备方法。

背景技术

精液保存是猪人工授精技术的关键，它既可以延长精子的贮存时间，又便于长途运输，同时扩大了精液的使用范围，提高公猪的配种效能，加快猪群品种改良。猪精液低温保存技术在运输和操作上，相对冷冻保存而言简便、经济，而保存时间比常温保存长、成本低。目前低温保存研究还停留在稀释液的筛选阶段。

冷冻保护是影响猪冻精质量的重要因素，自从人们发现甘油的冷冻保护特性后，迅速促进了家畜冷冻精液的发展，但是，甘油作为一种渗透性冷冻保护剂，能都渗入精子细胞的内部，浓缩或结合细胞内水分，降低溶液中盐的浓度和稀释液的渗透压，一方面对精子有保护作用，另一方面又对精子有一定的毒害作用，部分精子经脱水后冷冻效果较好，但结冻后却无运动力和受精能力。与牛精子不同的是，猪精子对低温打击极端敏感，而低温打击的主要危害是降低精子活力，增强精子膜的离子通透性，导致精子膜受到损伤和精细胞脂类物质的流失，而镜子膜的完整性对于精子的受精能力至关重要，近年来人们致力于研究非渗透性冷冻保护剂，并结合先稀释液中添加其他成分以改善冻后精子质量。

弱酸环境被认为是精液保存的理想环境，但超出一定的酸性范围，容易引起精子死亡。猪精子的等渗渗透压为290 ～ 300 mosM，可耐受的渗透压为240 ～ 380 mosM，等渗或稍微高渗的环境比低渗的环境更利于保护精子。可能与稀释液中添加缓冲剂碳酸氢钠和柠檬酸三钠有关，它们可以维持精液pH 的动态平衡，虽然成分只有葡萄糖和蔗糖，但二者即作为营养成分满足了精子的能量需要，又维持了渗透压，其中蔗糖在低温条件下还能保护精子的活力和顶体完整率。对于猪精子而言，弱酸和略高的渗透压更利于其4 ℃ 低温保存，人工采取的精液易受微生物的污染，而青霉素和链霉素作为稀释液中的抗菌剂，被广泛应用于常温保存稀释液中抑制微生物的生长繁殖，但二者对革兰氏阴性菌如大肠杆菌效果较差。有试验证明庆大霉素对多种革兰氏阴性菌有杀灭作用。

发明内容

一种低温保存猪精液的抗氧化稀释液制备方法，

猪精子与牛精子低温保存的效果不同，在猪精子的低温储存过程中，由于冷冻和解冻的过程发生脂质过氧化反应降低了精子的质量，并导致40~50%的精子失去活力，最主要原因是由于这一过程中精子与外界相互接触，致使精子中的活性氧增加，引起精子膜的流动性改变，线粒体和DNA损伤，降低了精液的品质。但是低温保存精液，低温可以减缓精子的运动，从而降低自身能量的损耗和新陈代谢，有效延长了精子的保存时间。

发明为了实现低温储存猪精液，同时解决以上出现的冷冻—解冻过程中过多活性氧出现导致的精子损伤率提高的问题，发明一种低温保存猪精液的稀释液，具体是通过以下的方法实现的：

（1）利用酵母的破碎提取液作为基础稀释液，后期添加其他活性成分，酵母提取液在提取的过程中从细胞溶出的物质包括：蛋白质、低分子肽、氨基酸、核酸降解物、微量元素和B族维生素等各种活性成分，都提供给精子相当完美的模拟生物细胞生存环境，各项活性成分的配比恰到好处，且成分全面，相对于人工配比的精液稀释液，添加的活性物质太多，量的方面不好拿捏，稍有不平衡就有导致稀释液渗透压的不稳定，导致精子因渗透压及其它方面的问题而死亡。

不仅如此，酵母细胞还富含丰富的海藻糖，海藻糖不同于蔗糖或是乳糖，它可以在生物活性细胞脱水的情况下，在细胞膜外形成一层保护膜，这一点可以在冷冻的过程中发挥保护细胞的作用，防止猪精子在降温过程中受到的低温打击。

首先采用的是啤酒酵母泥作为酵母菌的来源，废酵母泥是啤酒生产过程中的副产物，每年都会造成大量的浪费，这里经过3~5次的水洗，然后离心得到含有酵母菌细胞的酵母菌液，其啤酒酵母的有效活菌数不少于1.0×10⁶cfu/ml。

通过微波辐射的作用破碎酵母细胞，微波功率为600~800W的电磁作用环境下2~5min，微波是通过波场中介质的摆动摩擦作用产生能量，具有很好的选择性、瞬时性和高效性，细胞内不同位置的物质，对于微波的吸收能力存在差异，从而导致为波场中的细胞局部受热，细胞在一定的强度下出现缺口而破碎，起到充分裂解酵母细胞的功能。