[发明专利]化药/基因共转运功能化碳纳米管的制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种化药/基因共转运功能化碳纳米管的制备方法及应用。

背景技术

恶性肿瘤严重威胁着人类的健康，但其治疗效果差、转移率高，治疗困难较大。目前治疗恶性肿瘤的手段主要有外科手术治疗、化学药物治疗、放射治疗、免疫疗法和基因治疗等手段。常用的化学药物治疗虽然能够快速杀死肿瘤细胞，但药物缺乏选择性，会对正常的细胞或组织产生高毒副作用。基因治疗中使用的siRNA生物稳定性差，易被血清中的核酸酶降解，体内干扰持续时间短，这些缺点限制了其广泛应用。近年来，组合治疗在医药领域中得到了广泛应用。大量研究证实，化药和基因共给药具有增加药物抗肿瘤疗效和提高基因转染效率的协同作用，但是实现化药/基因共转运的挑战之一是共转运载体的构建。有效的共转运载体能良好地负载化药与基因，克服体内、胞内的各种屏障，特异性识别靶向部位，并将药物及基因递送至肿瘤细胞内，发挥抗肿瘤作用。因此，构建一种新型化药/基因共转运纳米载体，改善化药和siRNA在治疗中的缺陷，并发挥药物与基因的协同作用具有重要的科学意义。

碳纳米管(Carbon Nanotubes,CNTs)是单层或多层的石墨卷曲形成的圆柱状结构材料，作为一种新型的纳米载体，因其独特的物理、化学和生物学性能，引起了人们广泛的关注。单壁碳纳米管(Single-walled Carbon Nanotubes，SWCNTs)是一种特殊的CNTs，它具有比表面积大、非特异性吸附、高细胞穿透能力等特点，在载体研究中占据了很大的空间。原始的CNTs由于其自身所具有的疏水结构，使其难以均匀分散于体液中，容易在生物组织和细胞中聚集，故需采用化学的方法对原始CNTs进行共价或非共价修饰，不仅能够有效地提高CNTs在溶剂中的分散性和生物相容性，而且进入生物体内的CNTs还可以通过肾脏代谢等途径，通过尿液将其排出体外。CNTs具有类似石墨表面的π-π共轭结构，使得其表面具有很强的吸附药物分子的能力。基因或核酸、蛋白质以及其他难溶性的含芳环药物等可以通过物理包覆和π-π吸附等方式加载到CNTs表面。因此，CNTs作为一种新颖的药物和基因载体，可以实现药物和基因在生物体内的高效转运和利用。

聚乙烯亚胺(Polyethyleneimine，PEI)作为一种非病毒商业化基因载体而被广泛地应用。PEI具有较强的核酸结合能力、细胞黏合能力和缓冲能力，因其“质子海绵”效应，PEI与基因复合物被内吞进入细胞后，能在内涵体的酸性环境中吸收H⁺，使其渗透压增高，导致膜不稳定甚至破裂，从而使被吞噬的复合物逃逸出来，避免了DNA被溶酶体内酶的降解。大分子量的PEI具有高效的基因转染效率，但因其大量正电荷的存在以及非生物降解性，显示出较大的细胞毒性；低分子量的PEI毒性低，但基因转染效率也随之降低，这样就严重限制了它在临床医学中的应用。

靶向穿透肽BR2是一种含有17个氨基酸的多肽，该靶向穿透肽能特异性地识别肿瘤细胞，通过与癌细胞表面神经节苷脂的相互作用，从而进入细胞；同时，BR2可使纳米粒靶向进入肿瘤细胞，提高siRNA的转染效率。

至今未出现以新型功能化SWCNTs为载体，同时负载抗肿瘤药和siRNA，构建肿瘤微环境响应性化药与基因共转运的靶向纳米载体。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种化药/基因共转运功能化碳纳米管的制备方法及应用，本发明的制备方法操作简单、易得、可靠，所制备的功能化碳纳米管在水中分散性和生物相容性较好，药物及基因负载能力高，具有明显的肿瘤细胞靶向能力和控制药物、基因释放的能力。

本发明的提供了一种化药/基因共转运功能化碳纳米管的制备方法，包括以下步骤：

(1)将甜菜碱与聚乙烯亚胺在有机溶剂中于20-40℃下搅拌反应，透析后得到聚合物单体；

(2)将表面酰氯化的碳纳米管在保护气氛下，在有机溶剂中与步骤(1)得到的聚合物单体于60-85℃下反应，离心、洗涤沉淀后得到聚合物修饰的碳纳米管；

(3)将抗癌药物与步骤(2)得到的聚合物修饰的碳纳米管在pH为6.0-8.0的缓冲溶液中混匀，搅拌12-24h，离心后在上清液中加入步骤(2)得到的聚合物修饰的碳纳米管，重复多次直至上清液无色，得到载药功能化碳纳米管；

(4)将步骤(3)得到的载药功能化碳纳米管、磷脂-聚乙二醇-马来酰亚胺、靶向穿透肽BR2-SH以及siRNA在葡萄糖水溶液中混匀，在30-40℃下进行孵育，得到化药/基因共转运功能化碳纳米管。