[发明专利]儿童自闭症肠道菌群多样性的分析方法及特异性引物对

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术检测领域，具体地，本发明提供了一种基于二代高通量测序技术的检测疾病患者体内肠道菌群多样性的技术和方法。

背景技术

肠道内数以亿计的微生物及其代谢产物在人体能量代谢、营养物质吸收、先天和获得性免疫、胃肠道功能等方面发挥着重要作用,一旦宿主与肠道微生物之间共栖共生的稳态被打破,就会诱发多种人类疾病。目前已经认识到肠道微生物与人类健康和疾病的密切关系,仅仅从人类自身角度出发来研究人类疾病远远不够,必须考虑到与人类共栖共生的肠道微生物的作用。

目前应用于人体肠道微生物的多样性及差异化的研究方法较多，主要有传统检测方法、构建基因文库法、遗传指纹图谱技术、分子杂交技术和DNA测序技术等方法。其中传统微生物检测方法是用各种培养基培养分离微生物，并通过革兰染色、生物化学和血清学试验等方法来确定微生物种类，通过倍比稀释、菌落计数等方法来测定微生物数量。但由于传统微生物培养技术中，菌株的富集或衰减不可避免，原始的微生态结构被改变，这会导致研究结果存在较大偏差。

综上所述，应用和开发针对疾病患者肠道菌群的多样性及差异性的检测方法，能够为人们更好的了解肠道微生物以及疾病之间的相互关系的技术支撑和理论基础。

发明内容

本发明的目的即在于提供一种针对泌尿系统疾病患者肠道菌群的多样性及差异性的检测方法。

本发明的再一个目的是提供一种通过设计特异性引物(人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与目的基因一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与目的基因另一端的另一条DNA模板链互补)，适用于多种类疾病患者肠道菌群的多样性及差异性的检测方法。

本发明的又一个目的在于为人们更好的了解肠道微生物以及疾病之间的相互关系的技术支撑和理论基础。

1.在本发明中，所述引物对(上、下游引物统称为一对引物)不限于由所述序列所示的两条单链DNA分子组成的引物对，只要是能够特异性扩增所有需要检验的微生物来源的引物对均可。

本发明提供了一种检测自闭症患儿及其父母的肠道菌群的多样性及差异性的特异性引物对，其特征在于，所述引物对是能够特异性扩增所有需要检验的微生物来源的引物对。所述引物对是由两条单链DNA分子序列组成的引物对。所述引物对的

上游引物为：5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’；

下游引物为：5’-GCTGCCTCCCGTAGGAGT-3’。

所述的引物对，用于生物技术及检测领域，通过二代高通量测序技术，精准检测自闭症患儿及其父母的肠道菌群的多样性及差异性。

2.本发明还提供一种判定待测疾病患者体内肠道菌群的多样性及差异性的方法，其特征在于包括以下步骤，

(1)提供一待测粪便样品；

(2)从所述粪便样品中，提取其样本DNA；

(3)配置PCR反应体系，进行PCR反应；

(4)对于PCR反应产物进行目标片段的检测；

(5)对于有目的片段的PCR产物进行PCR产物纯化；

(6)以步骤5中PCR产物为检测对象，用二代高通量测序技术进行粪便样本中的微生物种类的检测；

(7)对于二代测序结果进行数据分析及处理。

3.本发明所述粪便样本的采集及粪便样本DNA的提取方法为：

(1)所述粪便样本的采集方法具体为：

1)粪便排入一个清洁且干燥的容器内。注：容器内不能混入尿液。

2)用采样管中的小勺来收集粪便，为防止粪便表层污染，需用取样勺轻轻扒开表层，在粪便内部取样，将装有粪便的小勺放入采样管中。

3)将采样管的盖拧紧，做好信息记录，包括被采样者姓名、住院号及采样时间。

(2)所述粪便DNA提取方法具体为：

用2.0克左右的粪便样本，选择用改进的CTAB抽提法进行样本DNA的提取。

1)将冻存管内的取样勺取出(尽量涮洗干净，不留样品)12000转速，离心2分钟。

2)用移液枪吸出乙醇(尽量吸干净)，加入300微克65℃预热的2×CTAB搅拌震荡为悬浊液。

3)EP管缠绕封口膜后95℃水浴加热8分钟。

4)加入300微升酚仿(取下层)混合液，振荡混匀，10000转速，离心5分钟；

5)将上清液200ul移至新的1.5毫升无菌离心管中，加入3倍体积(600微升)的溶胶液，振荡混匀，分两次(每次约400微升)移入硅质柱，静置2分钟，12000转速离心30秒；