[发明专利]一种检测尿外泌体荷载miRNAs的试剂盒和方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测尿外泌体荷载miRNAs的试剂盒和方法。

背景技术

肾纤维化(Renal fibrosis，RF)，包括肾间质纤维化和肾小球硬化，是一个动态发展的过程,标志着不可逆性肾损伤,是影响各类肾脏疾病的治疗及预后的重要因素之一。[罗海清,梁冬,刘华锋.肾间质纤维化的形成机制及中医药防治作用.中国中西医结合肾病杂志,2004,5(7):432-434.]因此,延缓和阻断肾纤维化是防治肾损害的关键,也是目前国内外肾脏病研究的热点。能否及时、准确地判断是否存在肾纤维化及其程度,有助于临床医生合理制定治疗方案及较准确地判断预后。

临床上肾纤维化诊断有赖于肾脏病理学诊断,而肾活检是一种有创性检查,对于有肾活检禁忌证的患者则无法施行；无法广泛的在基层医院开展。并且,鉴于医学伦理学,难以通过重复肾活检对病情作动态监测,而且患者也不易接受。因此,寻找一组无创性诊断指标对肾纤维化的诊断、病情动态观察、疗效的客观评价,有着积极的临床意义。

过去，一些血、尿蛋白被用于肾纤维化的诊断，如透明质酸、层粘蛋白、Ⅲ型前胶原、Ⅳ型胶原等[许筠，张少山，程保智，等.测定血清等对肾纤维化诊断的意义.兰州大学学报(医学版)，2011，37(4)：24-27、32.]，可以在一定程度上反应肾纤维化的进程，但这些蛋白直接暴露于体液中，容易降解而使结果不稳定，不能实时的反应病变。miRNAs分子是近年研究的热点，但目前还没有得到公认的用于检测肾纤维化的miRNAs分子诊断标志物。

近年来,液体活检方法诊断肾纤维化的价值日益受到人们的重视。尿外泌体(Exosome)膜中包含特征性蛋白和核酸，比裸露的蛋白、核酸更稳定的反映肾小球和肾小管细胞损伤和修复情况、间质炎症、基质沉积等，从而反应纤维化和疾病进程。同时，由于尿液取样方便，无创且可反复取样，因此，检测尿外泌体中标志性分子，成为液体活检研究中的热点，可以实时了解肾纤维化的进程。

比如，[Lv LL，Cao YH，Ni HF，et al.MicroRNA-29c in urinary exosome/microvesicle as a biomarker of renal fibrosis[J].Am J Physiol Renal Physiol，2013，305(8):F1220-F1227.]等研究发现肾纤维化患者尿液中的mi R-29c较健康人呈低表达，能有效预测肾小球滤过率估算值(eGFR)和小管间质性纤维化程度，且能特异性区别轻度、中度和重度肾纤维化。因而，尿液exosome中的miR-29c与肾功能和纤维化程度的相关性，可以作为一种新的非侵入性肾纤维化指示分子。

但是，目前提取分离外泌体的方法多样，包括超速离心、密度梯度离心、免疫磁珠、超滤或试剂盒等方法，这些方法各有优缺点，超速离心法需要超速离心机，过程比较费时，且回收率不稳定(可能与转子类型有关)，纯度也受到质疑；此外，重复离心操作还有可能对囊泡造成损害，从而降低其质量。密度梯度离心法获得的外泌体纯度较高，但步骤繁琐，耗时。超滤离心法简单高效，且不影响外泌体的生物活性，是提取细胞外泌体的一种新方法。磁珠法具有特异性高、操作简便、不影响外泌体形态完整等优点，但是效率低，外泌体生物活性易受pH和盐浓度影响，不利于下游实验，难以广泛普及。试剂盒价格昂贵，不适合大规模检测。

发明内容

本发明提供了一种检测尿外泌体中的miR-29c的试剂盒和方法。

本发明检测尿外泌体荷载miRNAs的试剂盒，它包括外泌体提取试剂和miRNAs检测试剂，其中，提取试剂为聚乙二醇和氯化钠的混合溶液。

优选地，所述聚乙二醇和氯化钠的混合溶液中，聚乙二醇的浓度为 0.16～0.24g/ml，所述氯化钠的浓度为0.0584g/ml。

优选地，所述聚乙二醇和氯化钠的混合溶液中，聚乙二醇的浓度为 0.16g/ml。

优选地，所述miRNAs检测试剂为qPCR检测试剂，优选地，所述qPCR 检测试剂为基于茎环法的M-MLV Frist Strand cDNA Synthesis Kit(OMEGA) 和Green PCR Master Mix(Applied biosystems)试剂盒。

优选地，它还包括RNA提取试剂，所述RNA提取试剂为Trizol试剂。

本发明还提供了一种检测尿外泌体荷载miRNAs的方法，步骤如下：

(1)取尿液，采用权利要求1～4任意一项所述试剂盒中的提取试剂提取尿外泌体；