[发明专利]含人间充质干细胞分泌物的小型宠物滴眼液及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及干细胞分泌物，尤其是一种含有人间充质干细胞分泌物的滴眼液及其制备方法。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)是一组源于基质的异质细胞群，可以从人体大多数组织获取。它们具有自我更新能力、组织修复、免疫调节能力，可以向中胚层谱系分化，例如：脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞等，此外还能够向及其它胚层谱系细胞分化，例如向表皮细胞/血管内皮细胞分化。

间充质干细胞培养体系中含有多种大量的活性成分，如：干细胞生长因子(SCF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、内皮细胞生长因子(VEGF)、表皮细胞生长因子(EGF)、细胞集落刺激因子、白细胞介素(IL)、胶原蛋白、透明质酸等80余种活性物质。目前，已经有将间充质干细胞应用于修复视网膜损伤、烧伤角膜等的报道。但是由于活性细胞的存活条件比较苛刻，很容易死亡因此由活细胞所起的作用也会大打折扣。

透明质酸具有抗炎抗菌、缓解眼部疲劳；治疗眼干眼燥症；添加透明质酸增加滴眼液的润滑性和舒适性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种活性稳定的含人间充质干细胞分泌物的小型宠物滴眼液及其制备方法，利用干细胞分泌的多种细胞因子为治疗各种眼结膜及角膜溃疡疾病提供了安全、有效、使用方便的治疗药物。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种含人间充质干细胞分泌物的小型宠物滴眼液的制备方法，包括以下步骤：

(1)人间充质干细胞培养：从细胞库中选取P2-P6的人间充质干细胞复苏，接种批次记为第一批次、第二批次、第三批次，接种密度分别为最大融合度的50％-60％、35％-45％、20％-30％；细胞接种完成，放于二氧化碳培养箱培养，温度37℃，二氧化碳体积比浓度5％；

(2)第一批次细胞融合度达到70％-80％时，以生理盐水清洗细胞2次，用复方电解质注射液进行饥饿培养；

(3)饥饿培养12-24小时后，第一批次细胞融合度达90％-95％，收取细胞培养上清，3000-4500g条件下离心5-8min除去沉淀，取离心后上清备用；

(4)取培养的第二批次细胞，当细胞融合度达到70％-80％，以生理盐水清洗第二批次细胞2次，用步骤(3)中细胞培养上清进行饥饿培养；

(5)饥饿培养12-24小时后，第二批次细胞融合度达90％-95％，收取细胞培养上清，3000-4500g条件下离心5-8min除去沉淀，取离心后上清备用；

(6)取培养的第三批次细胞，当细胞融合度达到70％-80％，以生理盐水清洗第三批次细胞2次，用步骤(5)中细胞培养上清进行饥饿培养；

(7)饥饿培养12-24小时后，第三批次细胞融合度达90％-95％，收取细胞培养上清，3000-4500g条件下离心5-8min除去沉淀，取离心后上清放于4℃备用；

(8)将步骤(7)中的备用上清，以0.22um滤膜过滤，在过滤后的上清中添加质量百分比1％-5％透明质酸，混匀后分装到无菌的一次性滴眼液瓶中，放到4℃冰箱中保存待用。

所述人间充质干细胞为人脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、牙髓间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、胎盘间充质干细胞或月经血间充质干细胞。

上述制备方法制得的含人间充质干细胞分泌物的小型宠物滴眼液。

本发明的有益效果是：将间充质干细胞进行饥饿培养，使得细胞分泌的各种活性成分的浓度都得到了提高，并且在短时间内使用饥饿上清重复饥饿间充质干细胞，使细胞提取物浓度进一步增加，再配合添加的透明质酸有效成分，可促进眼结膜及角膜的修复，缩短眼结膜及角膜溃疡伤口的愈合时间，并起到消除炎症，促进经久不愈的溃疡愈合等作用，且滴眼液不含有防腐剂不会对眼睛造成伤害，一次性使用更加安全、方便。

附图说明

图1不同饥饿次数人脐带间充质干细胞提取物中有效因子分泌量比较图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明：

本发明的含人间充质干细胞分泌物的小型宠物滴眼液的制备方法，包括以下步骤：

(1)间充质干细胞培养：从细胞库中选取P2-P6的间充质干细胞复苏，接种批次记为第一批次、第二批次、第三批次，接种密度分别为最大融合度的50％-60％、35％-45％、20％-30％；细胞接种完成，放于二氧化碳培养箱培养，温度37℃，二氧化碳体积比浓度5％；