[发明专利]一种温度响应型智能细胞培养容器的制作方法

说明书

本发明提供了一种温度响应型智能细胞培养容器的制作方法，步骤如下：(1)将聚(N‑异丙基丙烯酰胺)纳米凝胶颗粒均匀分散在温度为4～25℃、pH值为7～10的灭菌Tris缓冲液中得到纳米凝胶颗粒分散液，将盐酸多巴胺溶解于纳米凝胶颗粒分散液中得到修饰液；(2)将修饰液加入细胞培养容器中使修饰液浸没细胞培养容器的待修饰部位，在有氧条件下于20～40℃反应至少3h，然后用去离子水清洗经过前述处理的细胞培养容器，再将清洗后的细胞培养容器在20～50℃干燥去除细胞培养容器表面的水分，即完成温度响应型智能细胞培养容器的制作。该方法的工艺简单、生产成本低廉，并且制作的温度响应型细胞培养容器的使用稳定性好。

技术领域

本发明属于温度响应型细胞培养容器领域，特别涉及一种温度响应型智能细胞培养容器的制作方法。

背景技术

对于贴壁生长的细胞，将其从细胞培养板、培养瓶或培养皿的壁面脱附转移是细胞工程和组织工程中最基本，也是最常涉及的实验操作之一。目前常用的细胞脱附方法是胰蛋白酶(简称胰酶，Trypsin)消化法。胰酶是蛋白酶的一种，其在脊椎动物体内起到消化酶的作用，胰酶的作用是将细胞与细胞之间以及细胞与培养容器表面之间的细胞外基质蛋白(Extracellular Matrix，ECM)水解，从而分离细胞，因此在动物细胞培养过程中可用于分散组织中的细胞以及使贴壁生长的细胞脱落。然而胰酶除了能消化细胞间的基质蛋白外，长时间作用也会消化细胞膜蛋白，对细胞有损伤作用。因此在使用胰酶消化细胞时，需要严格第控制胰酶的浓度、作用时间、温度以及冲洗次数等参数。在弱碱性、温度为37℃的条件下，胰酶溶液的消化能力最强，但操作时稍有疏忽就容易对细胞的膜结构和功能的完整性造成破环，进而造成细胞活性的下降，甚至导致细胞死亡。

近年来，温度响应型表面被广泛地应用于细胞培养和组织工程等领域。2001年5月，日本CellSeed公司成立，标志着温度响应型高分子材料正式进入实际的商用领域。该公司基于聚(N-异丙基丙烯酰胺)(Poly(N-isopropylacrylamide),PNIPAM)温敏型高分子材料对细胞培养板进行改性涂层，得到了具有温度响应特性的细胞培养板。使用这种细胞培养板进行细胞培养，可简单的通过改变环境温度使细胞脱离细胞培养板壁面，避免了使用胰酶吹洗细胞的过程。相比于传统的细胞脱附方式，这种细胞培养板为细胞的脱附转移提供了高效、对细胞无伤害、无需外加化学试剂的手段。虽然基于PNIPAM的细胞培养板已被商业化使用，但研究者们始终未放弃对制作温度响应型细胞培养板的研究，这主要是由于目前制作温度响应型表面的方法还存在各种局限性。

目前，将PNIPAM高分子修饰在细胞培养板表面的方法主要有化学接枝法和物理沉积法。化学接枝法主要通过电子束照射法(见Yamada,N.；Okano,T.；Sakai,H.,etal.Makromolekulare Chemie Rapid Communications 1990,11(11),571.)、等离子体处理法(见Okano,T.；Yamada,N.；Sakai,H.,et al.Journal of Biomedical MaterialsResearch 1993,27(10),1243.)、以及表面活性自由基聚合等方法(见Takahashi,H.；Nakayama,M.；Yamato,M.,et al.Biomacromolecules 2010,11(8),1991.)将PNIPAM高分子刷接枝在细胞培养板表面；物理沉积法主要是利用静电作用将PNIPAM高分子链或PNIPAM纳米凝胶颗粒沉积在细胞培养板表面(见Schmidt,S.；Zeiser,M.；Hellweg,T.,etal.Advanced Functional Materials 2010,20(19),3235.)。