[发明专利]病毒活性快速检测方法

说明书

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种病毒活性快速检测方法。病毒活性快速检测方法包括步骤：1)首先配制多巴胺/丹磺酰多巴胺混合溶液；然后将多巴胺/丹磺酰多巴胺混合溶液、宿主靶细胞与载体混合均匀，在载体表面进行聚合反应得到宿主靶细胞‑丹磺酰多巴胺/多巴胺‑载体复合体；最后利用洗脱剂将宿主靶细胞从复合体上洗脱下来，得到荧光分子印迹聚合物；2)向荧光分子印迹聚合物中加入宿主靶细胞和病毒样品，即刻测定荧光值为I0，待病毒样品中的病毒完全侵染宿主靶细胞后，测定荧光值为I，I/I0‑1表示荧光变化水平，通过荧光变化水平确定病毒样品中是否含有靶病毒以及该靶病毒的含量。该检测方法具有快速、安全、准确的特点。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种病毒活性快速检测方法。

背景技术

人类的很多疾病由病毒引起，目前有效的抗病毒性药物较少，病毒性疾病的防治主要需要依靠疫苗等进行预防。因此要控制病毒的传播、最小化病毒所致死亡率，对病毒活性进行快速、准确的检测至关重要。

病毒需要在宿主细胞内才能增殖，活病毒首先通过随机碰撞、静电引力，与宿主细胞形成非特异性吸附；然后病毒通过自身的粘附素与宿主细胞表面的特异性黏附受体结合，导致细胞膜发生改变，病毒核酸或病毒进入靶细胞内，进行生物合成、装配和释放。传统病毒检测方法是通过测定活病毒感染并杀死宿主细胞后形成的空斑数量(空斑形成单位，plaque forming unit,PFU)，测定是否存在活病毒，计算空斑形成单位(PFU)确定病毒滴度，并进一步对病毒进行分型。空斑形成实验是病毒活性的金标准，但由于通过观察病毒裂解细胞后形成的空斑检测病毒活性和病毒滴度，培养时间长，通常需要2-4天的时间，且干扰因素多，操作步骤繁多，需要一定熟练程度的人来操作，无法满足实际需要，更重要的是有些情况下病毒不能被培养出来。PCR 和免疫荧光等方法可灵敏快速地测定靶病毒滴度和分型，但这些方法均无法测定病毒活性。因此，开发无需培养的病毒活性快速检测技术，在病毒性疾病的预防和控制中十分重要。

为了开发无需培养的病毒活性快速检测技术，本发明利用分子印迹聚合物(molecularly imprinted polymers，MIPs)，目前，细菌的MIPs 制备已有少量研究，对哺乳动物细胞的MIPs则极少有报道。在细菌MIP中，部分研究者以细菌表面蛋白为模板制备MIPs，例如Khan等人在单壁碳纳米管上，以金黄色葡萄球菌外层有代表性的蛋白A为模板，通过循环伏安法使3-氨基酚发生电聚合制备MIPs，在有牛血清白蛋白干扰的情况下，MIPs对模板仍有良好的选择性(Khan MSR, Moreira FTC,Riu J et al.Plastic antibody forthe electrochemical detection of bacterial surface proteins.Sensor Actuat B-Chem,2016,233: 697-704.)。Jiang等人在磁性纳米颗粒表面，以革兰阴性菌的信号分子AHLs为模板，通过表面印迹制备了MIPs，可对细菌进行间接检测 (Jiang H,Jiang D,ShaoJ et al.Magnetic molecularly imprinted polymer nanoparticles basedelectrochemical sensor for the measurement of Gram-negative bacterial quorumsignaling molecules (N-acyl-homoserine-lactones).Biosens Bioelectron,2016,75:411-419.)。 Idil等人以整个大肠杆菌为模板，以N-甲基丙烯酰-L-组氨酸、2-甲基丙烯酸羟乙酯为功能单体，以乙二醇二甲基丙烯酸为交联剂，用紫外光进行引发，制备大肠杆菌MIPs，可特异性吸附模板大肠杆菌。对大肠杆菌的检出限为70CFU/mL，检测范围为1.0×102-1.0×107CFU/mL。该方法用于果汁和河水中加标大肠杆菌的检测，回收率为81-97％(Idil N,Hedstrom M,Denizli A et al.Whole cell based microcontact imprintedcapacitive biosensor for the detection of Escherichia coli.BiosensBioelectron,2017,87:807-815.)。Roy等人以整个大肠杆菌为模板，以 N,N’-亚甲基双丙烯酰胺为功能单体制备大肠杆菌MIPs。与亚铁/铁氰化物氧化还原探针连用，可实现对大肠杆菌的检测，且与大肠杆菌在 10-109CFU/mL范围线性相关，检出限为10CFU/mL。除了能检测外，该材料还可从水样中捕获超过98％的大肠杆菌。最后该材料还可以通过光热在5分钟内杀死10⁵CFU/mL大肠杆菌(Roy E,Patra S,Tiwari A et al.Single cell imprintingon the surface of Ag-ZnO bimetallic nanoparticle modified graphene oxidesheets for targeted detection, removal and photothermal killing ofE.Coli.Biosens Bioelectron, 2017,89(Pt 1):620-626.)。以上研究均表明细菌MIPs可特异性结合并检测靶细菌，但是，如何利用MIPs测定病毒活性至今仍是需亟待解决的问题。