[发明专利]靶向PD‑1的嵌合抗原受体分子及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及靶向PD-1的嵌合抗原受体分子及其应用。

背景技术

恶性肿瘤是一种严重威胁人类生命的疾病。恶性肿瘤或癌症的发病机理多种多样，其共同的表现在于变异的肿瘤细胞不受机体免疫系统的清除，能够无限制的繁殖和扩散，破坏周围组织的正常细胞和功能。长期以来，医药学界在尝试医治和控制肿瘤疾病的病程方面做了大量的努力，但收效甚微。目前，在恶性肿瘤的治疗上，除根除手术外，主流医学界的临床辅助治疗手段仍然是放射线治疗、化学药物治疗和抗体治疗。

1985年，美国科学家尝试分离病人的单个核细胞，并在体外用各种细胞因子诱导、激活、产生杀伤性T细胞(Cytokine-induced killer cells，CIK)，继而发现这些细胞通过静脉滴注回输给病人后，对肿瘤的生长有杀伤作用。经过近三十年的临床应用和技术发展，用免疫杀伤细胞治疗肿瘤已经成为第四种公认的恶性肿瘤辅助治疗手段。常见的用于临床治疗的免疫杀伤细胞：自然杀伤细胞(Natural killer cells，NK)、γδT细胞、细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocytes，CTL)、NK样T淋巴细胞(Natural killer-like T cells，NKT)、Th1效应细胞(Effector cells)等。抗原提呈细胞之一树突状细胞(Dentritic cells，DC)也常用于免疫细胞治疗的应用，DC可以提高免疫杀伤细胞的特异性、加强免疫杀伤细胞的活力。

免疫活性细胞对肿瘤细胞的识别和杀伤效果，取决于肿瘤细胞膜表面的受体分子表达，至少有两方面的因素导致体内的T淋巴细胞不能很好地识别癌细胞：(1)癌细胞下调抗原呈递分子的表达，(2)被呈递的抗原与T细胞受体亲和力很弱。虽然癌症患者体内存在癌细胞高度特异性的T淋巴细胞，但是数量太少起不到治疗癌症的作用。为了克服免疫杀伤细胞特异性低下的缺点，美国科学家发明一种转基因的方法：将识别肿瘤表面特异性抗原的单克隆抗体高变区序列在体外重组、亚克隆为单链抗体片段(Single chain antibody fragment of variable regions，scFv)，再与其他基因的跨膜蛋白片段和胞内信号肽融合形成人造的嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor，CAR)，转染至T细胞内而形成嵌合抗原受体T细胞(Chimeric antigen receptor，CAR-T)。嵌合抗原受体主要由两部分构成，一端位于细胞外能够特异性识别癌细胞表面的某一抗原，另一端位于胞内含有信号激活元件(如T细胞受体的Zeta链)，起传递信号激活T细胞的作用。

在正常情况下，人体的血液循环中存在少量的活性杀伤细胞，如NK，γδT细胞等，其作用在于清除衰老、变异的组织细胞或抵御病毒入侵。免疫细胞的活性主要受到T调节细胞(Regulatory T cells，Treg)的控制，当T调节细胞的控制减弱时，会造成免疫功能亢进或产生自身免疫性疾病；当控制增强时，会使免疫功能低下，滋生肿瘤或其他病毒性皮肤病。目前确认的参与负调节的蛋白因子有细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA4)和程序性死亡蛋白1/程序性死亡蛋白1配基1(Programmed cell death protein 1/Programmed cell death protein 1 ligand 1，PD-1/PD-L1)等分子。抑制性T调节细胞表达CTLA4，可以与免疫细胞DC和T细胞表面的B7族蛋白亚基相互作用，抑制免疫细胞功能。B7蛋白家族成员有B7-H1(PD-L1)，B7-H2(PD-1L2)等。B7-H1(PD-L1)也可以通过结合淋巴细胞PD-1分子，进一步抑制靶细胞的活性功能。PD-1和PD-L1相互作用对T细胞功能的抑制是免疫细胞治疗肿瘤的一个主要障碍。在大多数实体瘤组织中，癌细胞表达PD-L1/PD-1的水平增高，对浸润到癌组织的活化淋巴细胞产生直接的抑制，这也是肿瘤逃逸机体免疫监管的机制之一；活化T细胞表面PD-1的表达增加，更容易受到负调节的抑制。最新的抗体药物keytruda和opdivo已被美国FDA批准临床治疗恶性肿瘤，其作用原理是阻断CTLA4/B7以及PD-1/PD-L1的相互结合，从而解除体内T调节细胞或癌细胞对活性T杀伤细胞的抑制，让体内免疫活性细胞对肿瘤细胞进行杀伤、清除。

发明内容