[发明专利]含人间充质干细胞外泌体提取物的矽肺病治疗雾化剂及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及干细胞外泌体提取物，尤其是一种含人间充质干细胞外泌体提取物的矽肺病治疗雾化剂及其制备方法。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)是一组源于基质的异质细胞群，可以从人体大多数组织获取。它们具有自我更新能力、组织修复、免疫调节能力，可以向中胚层谱系分化，例如：脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞等，此外还能够向及其它胚层谱系细胞分化，例如向表皮细胞、血管内皮细胞分化。

间充质干细胞培养体系中含有多种大量的活性成分，如：干细胞生长因子(SCF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、内皮细胞生长因子(VEGF)、表皮细胞生长因子(EGF)、细胞集落刺激因子、白细胞介素(IL)、胶原蛋白、透明质酸等80余种活性物质。研究证明干细胞分泌的活性物质大多是以外泌体的形式存在，外泌体能够很好的与细胞膜融合，从而将内部的活性物质运输到靶向细胞的内部发挥作用。目前，已经有将间充质干细胞应用于肺损伤及肺纤维化修复的报道,但是由于活性细胞的存活条件比较苛刻，很容易死亡，因此由活细胞所起的作用也会大打折扣。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种含间充质干细胞外泌体提取物的矽肺病治疗雾化剂及其制备方法，利用高浓度的间充质干细胞分泌外泌体提取物，为矽肺病的治疗提供了安全、有效、使用方便的雾化剂。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种含人间充质干细胞外泌体提取物的矽肺病治疗雾化剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)人间充质干细胞培养：从细胞库中选取P2-P6的人间充质干细胞复苏，接种批次记为第一批次、第二批次、第三批次，接种密度分别为最大融合度的50％-60％、35％-45％、20％-30％；培养细胞所用完全培养基为无酚红DMEM/DF12和体积比浓度为10％胎牛血清；细胞接种完成，放于二氧化碳培养箱培养，温度37℃，二氧化碳体积比浓度5％；

(2)第一批次细胞融合度达到70％-80％时，以生理盐水清洗细胞2次，用复方电解质注射液进行饥饿培养；

(3)饥饿培养12-24小时后，第一批次细胞融合度达90％-95％，收取细胞培养上清，3000-4500g条件下离心5-8min除去沉淀，取离心后上清备用；

(4)取培养的第二批次细胞，当细胞融合度达到70％-80％，以生理盐水清洗第二批次细胞2次，用步骤(3)中细胞培养上清进行饥饿培养；

(5)饥饿培养12-24小时后，第二批次细胞融合度达90％-95％，收取细胞培养上清，3000-4500g条件下离心5-8min除去沉淀，取离心后上清备用；

(6)取培养的第三批次细胞，当细胞融合度达到70％-80％，以生理盐水清洗第三批次细胞2次，用步骤(5)中细胞培养上清进行饥饿培养；

(7)饥饿培养12-24小时后，第三批次细胞融合度达90％-95％，收取细胞培养上清，3000-4500g条件下离心5-8min除去沉淀，取离心后上清备用；

(8)连续饥饿三次后将收集的步骤(7)上清以0.22um滤膜过滤，提取其中的干细胞外泌体，以20-40ml的生理盐水重悬分离获得的外泌体制备成雾化剂，放于4℃冰箱中保存。

所述人间充质干细胞为人脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、月经血间充质干细胞或牙髓间充质干细胞。

上述的制备方法制得的含人间充质干细胞外泌体提取物的矽肺病治疗雾化剂。

本发明有益效果：将细胞进行饥饿培养，使得细胞分泌的含有各种活性成分的外泌体的浓度得到了提高，并且在短时间内使用饥饿上清重复饥饿间充质干细胞，使细胞提取物中外泌体的浓度进一步增加。而高浓度的间充质干细胞外泌体提取物可促进内膜组织分化、血管新生、肉芽组织生长，促使损伤组织结构再生修复，减少组织的纤维化，调节肺部免疫微环境，显著改善组织纤维化问题，减少创面组织的细菌感染及炎症反应。

附图说明

图1为本发明的方法培养的间充质干细胞图；

图2为不同饥饿次数人脐带间充质干细胞外泌体提取物中有效因子分泌量比较图；

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明：

本发明的含人间充质干细胞外泌体提取物的矽肺病治疗雾化剂的制备方法，包括以下步骤：