[发明专利]一种酒瓶兰试管苗种质保存方法

权利要求书

1.一种酒瓶兰试管苗种质保存方法，其特征在于：该种质保存方法的详细步骤如下：

1）酒瓶兰幼株预处理：

将生长健壮、无病虫害、基部带侧枝的盆栽酒瓶兰植株置于5-6℃低温培养箱中，低温黑暗处理4-6d，然后掰下侧枝，将侧枝基部浸入装有0.01g/L的多氯苯甲酸溶液中，5-6℃低温预处理3-4天；

2）外植体取材、消毒与接种

将预处理后的酒瓶兰侧枝超纯水洗净后转入超净工作台进行无菌操作，剥去叶片，露出酒瓶兰嫩茎，将嫩茎先用浓度为75%酒精浸泡30s，然后投入加入了数滴吐温80的0.1%升汞溶液中，表面消毒12-15m后用灭菌水冲洗3-5次，滤纸吸干，将嫩茎用灭菌解剖刀分割成0.8-1.2cm的小茎段，然后将小茎段正向接种于装有诱导培养基的三角瓶中；

3）不定芽诱导

培养室温度控制为26±1℃，光照强度控制为1200-1500Lx，光周期控制为光12h/暗12h，30-35天诱导出不定芽；

4）慢生长增殖保存种质：

将不定芽接种至慢生长增殖培养基A或慢生长增殖培养基B中，然后将三角瓶转移到低温、弱光条件下缓慢生长，12个月继代接种一次，慢生长增殖培养基A和慢生长增殖培养基B继代接种交替使用，然后继续进行慢生长增殖步骤；

5）复壮

当酒瓶兰种质保存期结束，需要进行酒瓶兰不定芽复壮，将慢生长增殖的不定芽转接入复壮培养基，然后转移到温度控制26±1℃，光照强度控制为1200-1500Lx，光周期控制为光12h/暗12h，获得健壮的酒瓶兰不定芽；

6）不定芽壮根后移栽：

将酒瓶兰不定芽转接到壮根培养基中，控制温度为23-25℃、光照强度为2000-2500 Lx培养条件下生长18-24天诱导生根，然后打开培养瓶炼苗7-10天后移栽入温室；

所述步骤2）中诱导培养基配方为：MS＋2，4-D 2mg/L+NAA 0.2mg/L+蔗糖40g/L+氯化2-羟乙基三甲铵0.3g/L+水解蛋白0.6g/L+活性炭1.5g/L+琼脂6.5g/L，pH 5.8-6.0；

所述步骤4）中的慢生长增殖培养基A的配方为：KNO₃ 2200～2600mg/L，NH₄NO₃ 1600～1800mg/L，KH₂PO₄ 160～180mg/L，CaCl₂∙2H₂O 430～450mg/L，MgSO₄∙7H₂O 360～380mg/L，Na₂-EDTA 30～35mg/L，FeSO₄∙7H₂O 22～26mg/L，MnSO₄∙4H₂O 21～24mg/L，ZnSO₄∙7H₂O 8～9mg/L，H₃BO₃ 0.1～0.2mg/L，KI 0.6～0.8mg/L，肌醇90～110mg/L，甘氨酸1.8～2.2mg/L，白喉霉素0.6～0.8mg/L，维生素B1 0.35～0.45mg/L，维生素B6 0.45～0.55mg/L，蔗糖23～27g/L，甘露醇27～33g/L，植物凝胶5.2～5.8g/L，NAA 0.15～0.25mg/L，2，4-D 0.8～1.2mg/L，调环酸钙0.9～1.1mg/L，山梨醇23～27g/L，水解蛋白0.9～1.1g/L，pH 5.8-6.0；

所述的慢生长增殖培养基B的配方为：KNO₃ 2200～2600mg/L，NH₄NO₃ 1600～1800mg/L，KH₂PO₄ 160～180mg/L，CaCl₂∙2H₂O 20～30mg/L，MgSO₄∙7H₂O 360～380mg/L，Na₂-EDTA 30～35mg/L，FeSO₄∙7H₂O 22～26mg/L，MnSO₄∙4H₂O 21～24mg/L，ZnSO₄∙7H₂O 0.1～0.2mg/L，H₃BO₃5～6mg/L，KI 0.6～0.8mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.04～0.06mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.15～0.2mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.15～0.2mg/L，肌醇90～110mg/L，甘氨酸1.8～2.2mg/L，白喉霉素0.6～0.8mg/L，维生素B1 0.35～0.45mg/L，维生素B6 0.45～0.55mg/L，蔗糖23～27g/L，甘露醇27～33g/L，植物凝胶5.2～5.8g/L，NAA 0.15～0.25mg/L，2，4-D 0.8～1.2mg/L，调环酸钙0.9～1.1mg/L，山梨醇 23～27g/L，水解蛋白 0.9～1.1g/L，pH 5.8-6.0；

所述步骤4）中的低温、弱光条件为：培养温度控制为6-8℃，光照强度控制为500-600lx，光周期控制为光12h/暗12h；

所述步骤5）中的复壮培养基的配方为：MS+2.5mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+3%蔗糖+0.8g/L水解蛋白+5.5g/L植物凝胶，pH 5.8-6.0；

所述步骤6）中的壮根培养基的配方为：1/2MS+多效唑0.1mg/L+蔗糖15g/L，pH为5.8。

2.根据权利要求1所述的酒瓶兰试管苗种质保存方法，其特征在于：所述步骤4）中的继代次数不超过4次。