[发明专利]一种适用于CRISPR/Cas9系统的基因组DNA片段编辑精准度的分析方法及应用

权利要求书

1.一种基因组DNA片段编辑精准度的分析方法，适用于CRISPR/Cas9系统，所述分析方法将Cas9核酸酶对基因组DNA双链进行切割的方式区分为钝末端切割与突出末端切割，钝末端切割方式对应的切割末端占比为钝断裂末端占比，突出末端切割方式对应的切割末端占比为突出断裂末端占比，通过预测候选sgRNA组合在每种切割方式下对应的断裂末端序列，并结合所述钝断裂末端占比与突出断裂末端占比，来预测候选sgRNA组合及选用的Cas9核酸酶对基因组DNA片段编辑的精准度；所述钝末端切割是指：Cas9核酸酶在sgRNA的介导下对基因组DNA片段切割出平滑末端的切割方式；所述编辑精准度是指针对待分析的编辑方式，符合所述编辑方式的基因组DNA片段编辑中，精准编辑所占的比例；所述突出末端切割是指：Cas9核酸酶在sgRNA的介导下对基因组DNA片段切割出粘性末端的切割方式；

所述分析方法包括如下步骤：

(A)获得选用的Cas9核酸酶在候选sgRNA组合中各sgRNA的介导下对基因组DNA片段进行切割的精准度系数：

(1)预测sgRNA组合中的单个sgRNA及选用的Cas9核酸酶对待编辑基因组DNA片段切割时，在突出末端切割方式下对应的突出断裂末端序列，以及在钝末端切割方式下对应的钝断裂末端序列；

(2)按补平连接的方式来预测各个突出断裂末端序列对待分析基因组DNA片段编辑方式所得序列的影响；将精准符合预期编辑的各个突出断裂末端占比之和作为第一精准度参考因子C1的值；若都不能精准符合预期编辑，则第一精准度参考因子C1为0；

(3)按直接连接的方式预测所述钝断裂末端序列对待分析基因组DNA片段编辑方式所得序列的影响；若精准符合预期编辑，则将钝断裂末端占比作为第二精准度参考因子C2的值；若不能精准符合预期编辑，则第二精准度参考因子C2为0；

(4)将第一精准度参考因子C1的值与第二精准度参考因子C2的值相加获得该sgRNA及选用的Cas9核酸酶对待编辑基因组DNA片段进行切割的精准度系数X；

(B)获得候选sgRNA组合及选用的Cas9核酸酶对基因组DNA片段编辑的精准度：将候选sgRNA组合中各sgRNA对应的精准度系数X相乘获得该候选sgRNA组合及选用的Cas9核酸酶对基因组DNA片段编辑的精准度对基因组DNA片段编辑的精准度Z。

2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述候选sgRNA组合中，sgRNA的个数为两个及以上。

3.如权利要求1-2任一项所述的基因组DNA片段编辑精准度的分析方法用于基因组DNA片段编辑的用途。

4.一种基因组DNA片段编辑方法，利用权利要求1-2任一项所述的分析方法分析候选sgRNA组合及选用的Cas9核酸酶对基因组DNA片段的编辑精准度，采用编辑精准度较高的sgRNA组合及Cas9核酸酶，来编辑基因组DNA片段。

5.如权利要求4所述的基因组DNA片段编辑方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)针对待编辑的基因组DNA片段，根据需要的编辑方式，设计候选sgRNA组合；

(2)利用权利要求1-2任一权利要求所述的基因组DNA片段编辑精准度的分析方法，从所述候选的sgRNA组合中选择出针对所需要的编辑方式精准度较高的sgRNA组合；

(3)采用步骤(2)所选的sgRNA组合，利用CRISPR/Cas9系统对待编辑的基因组DNA片段进行编辑。

6.根据权利要求5所述的基因组DNA片段编辑方法，其特征在于，所述步骤(2)为利用权利要求1-2任一权利要求所述的基因组DNA片段编辑精准度的分析方法，分析各候选sgRNA组合与各候选Cas9核酸酶配合时，针对所需要的编辑方式的编辑精准度，从中选择精准度较高的sgRNA组合对以及与之配合的Cas9核酸酶；所述步骤(3)为采用步骤(2)所选的sgRNA组合以及与之配合的Cas9核酸酶，利用CRISPR/Cas9系统对待编辑的基因组DNA片段进行编辑。