[发明专利]茶叶悬浮单细胞的分离培养方法

说明书

本发明公开了一种茶叶悬浮单细胞的分离培养方法，包括茶树叶片的选取、无菌叶片的消毒、愈伤组织的诱导、液体悬浮细胞的培养、液体悬浮细胞的扩大培养、单细胞分离等步骤。本发明方法所制备的茶叶悬浮细胞生长速度快，代谢活性较高。建立了一个快速生长的悬浮细胞培养体系及单细胞分离方法，为茶叶细胞学研究和次级代谢产物的研究奠定基础。对后续茶树次生代谢产物的生产、代谢物细胞定位及代谢机理研究及外源化合物胁迫条件下茶树细胞代谢物变化及机制研究提供了很好的技术平台。

技术领域

本发明涉及植物组织培养技术领域，具体涉及通过植物组织培养的方法，获得茶树叶片的愈伤组织后，对愈伤组织进行单细胞分离获得茶叶悬浮单细胞的方法。

背景技术

茶树，拉丁文名：Camellia sinensis(L.)O.Ktze，山茶科、山茶属灌木或小乔木，嫩枝无毛。叶革质，长圆形或椭圆形。茶树的叶子可制茶(有别于油茶树)，种子可以榨油，茶树材质细密，其木可用于雕刻。

我国是茶叶传统出口大国，据相关数据显示，当前全球各个产茶国家中，我国的茶叶年产量居于第一位，出口总量居于第二位，仅仅低于肯尼亚。茶叶中含有对人体有益的茶多酚、氨基酸、咖啡碱等物质，具有提神醒脑、解毒利尿、“三抗三降”等功效，是世界三大无酒精饮料之一。茶树其高度的自交不亲和性、自交衰退、结实率低等限制了遗传改良工作的进行；另外细胞学平台的缺乏也阻碍了茶叶中主要内含健康功能成分的代谢机理的研究。利用茶树组织培养技术及单细胞培养技术，可以加快茶树育种、缩短育种周期，并可利用组织培养进行茶树次生代谢产物可以开展细胞学和遗传转化研究，包括：次生代谢产物的生产、代谢物细胞定位及代谢机理研究、并为外源化合物胁迫条件下茶树细胞代谢物变化及机制研究提供了很好的技术平台。

发明内容

本发明的目的在于提供一种通过植物组织培养技术，建立一个快速生长的茶叶细胞悬浮培养体系并且分离出茶叶单细胞，维持其可持续开发和利用，也为茶叶细胞学和次级代谢机理的研究与遗传转化研究奠定基础。

本发明是通过以下技术方案实现的：

茶叶悬浮单细胞的分离培养方法，其特征在于，通过外植体组织培养，获得愈伤组织，然后对愈伤组织进行悬浮培养后经分离获得茶叶悬浮单细胞。

进一步，所述外植体为茶树新稍上部幼嫩叶片。

进一步，对外植体进行进行愈伤组织培养的培养基为：MS+2.0mg/L2,4-D+0.5mg/LKT+蔗糖30g/L，+琼脂6.5-7.0g/L，pH5.8。

进一步，悬浮培养的培养基为B5+1.0mg/L 2,4-D+0.1mg/L KT+蔗糖20g/L。

进一步，悬浮培养的培养基为B5+1.0mg/L 2,4-D+0.1mg/L KT+蔗糖20g/L。

进一步，愈伤组织经25℃恒温摇床中，避光悬浮培养5-10天后，将悬浮细胞转入新配制的悬浮培养基中再继代培养培养21-28天；制备悬浮初代细胞时添加果胶酶，再经2-3次悬浮继代培养后，得到茶叶悬浮单细胞。

进一步，所述果胶酶需经过0.22um无菌滤膜处理，所述果胶酶添加量为悬浮培养基体积的3％-5％。

进一步，所述愈伤组织培养后还包括继代培养，所述继代培养基为MS+1.0mg/L2,4-D+0.1mg/L KT+蔗糖30g/L+琼脂6.5-7.0g/L，pH5.8。

进一步，所述外植体包括预处理，具体是指将采摘后幼嫩叶片流水冲洗1h，质量分数50％多菌灵溶液冲洗浸泡4h，2.0g/L的PVPP溶液浸泡1h，清水清洗3-4遍，然后将漂洗干净的叶片用质量分数75％乙醇消毒10秒，无菌水冲洗1次，质量分数0.1％升汞消毒10分钟，无菌水冲洗3次后用无菌吸水纸吸干叶表水。

与已有技术相比，本发明优点体现在：