[发明专利]基于长片段DNA捕获和三代测序的无创产前单体型构建方法

权利要求书

1.一种基于长片段DNA捕获和三代测序的无创产前单体型构建方法，其特征在于，包括：

（1）用孕妇和/或其丈夫外周血中的基因组DNA构建用于目标区域捕获的二代文库，且不需要使用子代样本构建文库；

（2）用目标区域捕获探针对目标基因及侧翼区域进行捕获以获得捕获文库，其中所述目标基因包含突变点；

（3）以所述捕获文库构建三代上机测序文库，并进行三代测序以获得测序读长；

（4）在所述测序读长上，从所述目标基因的所述突变点向两端延伸以寻找杂合的SNP位点，其中一条测序读长含有多个SNP位点时，该测序读长长度即是一条单体型的长度；

（5）不同测序读长重叠区域含有相同的一个或多个SNP位点时，该条单体型可成功向两端继续区分，直至出现存在一段区域无测序读长覆盖或测序读长检出的SNP位点都是纯合，最终得到与所述突变点连锁的单体型。

2.根据权利要求1所述的无创产前单体型构建方法，其特征在于，用于构建所述二代文库的所述基因组DNA的量是2μg以上。

3.根据权利要求1所述的无创产前单体型构建方法，其特征在于，所述构建用于目标区域捕获的二代文库包括如下步骤：

（1a）将所述基因组DNA打断成主峰为10K附近的DNA片段；

（1b）用磁珠纯化打断后的DNA片段；

（1c）片段选择5K至9K范围内的DNA片段；

（1d）对片段选择的DNA片段进行末端修复和3'端加A碱基；

（1e）使所述DNA片段与3'端带有T碱基的二代测序接头连接；

（1f）对接头连接产物进行LM-PCR预扩增，得到所述二代文库。

4.根据权利要求1所述的无创产前单体型构建方法，其特征在于，所述侧翼区域包括所述目标基因上下游500K区域。

5.根据权利要求1所述的无创产前单体型构建方法，其特征在于，所述构建三代上机测序文库包括如下步骤：

（3a）对所述捕获文库进行DNA损伤修复；

（3b）对所述捕获文库进行末端修复和纯化；

（3c）对纯化产物进行三代测序接头连接；

（3d）消化未连接的DNA片段和三代测序接头；

（3e）纯化连接产物，得到所述三代上机测序文库。

6.根据权利要求5所述的无创产前单体型构建方法，其特征在于，所述步骤（3d）使用核酸外切酶III和核酸外切酶VII消化未连接的DNA片段和三代测序接头。

7.根据权利要求5所述的无创产前单体型构建方法，其特征在于，所述步骤（3e）纯化连接产物进行三次。

8.根据权利要求1所述的无创产前单体型构建方法，其特征在于，所述三代测序的所述目标区域平均测序深度15×以上。

9.根据权利要求1所述的无创产前单体型构建方法，其特征在于，所述目标区域的捕获效率大于20%。

10. 根据权利要求1所述的无创产前单体型构建方法，其特征在于，所述三代测序采用三代单分子测序仪PacBio RS II实现。