[发明专利]一种TaqMan实时荧光定量PCR检测腐生葡萄球菌的方法

说明书

本发明公开了一种TaqMan实时荧光定量PCR检测腐生葡萄球菌的方法，选取腐生葡萄球菌特异的一段基因序列，基于该特异基因序列，设计引物与TaqMan探针；应用目标基因克隆质粒作为标准品，检测敏感性、扩增效率等指标，建立了腐生葡萄球菌的实时荧光探针定量PCR检测方法；除目标菌外，其它种属细菌的基因组DNA均无扩增信号，表明该方法具有很好的特异性，能够满足一般样品检测要求；所设计的探针具有极高的敏感性，最低检测限可达到每个PCR反应检出10个拷贝的目的基因；十倍倍比稀释标准品，3次重复实验均具有很好的重复性，表明该方法稳定，数据可靠；因此，本发明建立的实时荧光探针定量PCR方法是一种快速、准确的检测腐生葡萄球菌方法。

技术领域

本发明涉及一种Taqman探针荧光定量PCR方法，属于PCR技术领域，尤其涉及一种TaqMan实时荧光定量PCR检测腐生葡萄球菌的方法。

背景技术

腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)属于凝固酶阴性葡萄球菌属，呈球形葡萄串状排列，无鞭毛，无芽抱，经革兰氏染色呈紫色，是一种广泛分布在自然界、人体体表与外界相通的腔道中的革兰氏阳性球菌，为条件性致病菌，是引起年轻女性获得性尿路感染的常见病原菌之一。尽管，国内报道在尿液和生殖道分沁物等感染标本中检出腐生葡萄球菌阳性率不高,却有着重要的临床意义。同时，腐生葡萄球菌是奶牛隐性乳房炎的主要病原菌，也是希腊香肠、盐水鸭和中国侗族传统发酵肉中常见的菌种。在低温肉制品的贮藏过程中与肉品质发生劣变、货架期短密切相关，很大程度上影响了产品的销售、流通，给企业造成巨大的经济损失。因此，就目前该菌对人、动物、食品等构成的安全隐患，有必要建立一种高效的实验室检测手段，为腐生葡萄球菌的分离鉴定和流行病学调查奠定实验保障。

目前，对此菌检测方法主要是普通的分离培养，常规PCR检测即利用16S rDNA测序比对相结合的方法进行检测。在传统分离鉴定方法中，首先对样品进行平板培养，挑取不同菌落纯化，对各单菌落进行菌落形态和菌体形态观察，并进行生理生化反应等鉴定菌株，判断结果时只靠肉眼观察，生化鉴定试验操作繁琐，耗时费力，检测周期较长，从而阻碍了该检测方法的应用，没有足够可靠依据，降低实验的准确性。常规PCR及16S rDNA测序虽然避免了上述方法的缺陷，但存在实验室污染和临床样品中PCR存在抑制物造成假阴性等问题，限制了在快速检测诊断上的推广应用。与普通PCR相比，TaqMan PCR技术具有以下优点：通过对扩增曲线以及对数增长期的循环阈值(Ct)的分析，摒弃普通PCR方法受多种因素干扰的终点分析方法，能够对检测样品进行准确定量分析；将DNA扩增与检测过程融合为一体，可以实时、动态监测DNA扩增的全过程，省掉了PCR后处理过程，大大缩短了结果分析时间，使得该方法更加快捷、方便；由于在普通PCR基础上增加了一条可与模板互补配对的荧光探针，进一步提高了检测靶标核苷酸的特异性。因此，利用TaqMan探针技术建立了一种灵敏度高、特异性强和稳定性好的快速检测腐生葡萄球菌的实时荧光定量PCR方法。

发明内容

本发明提出了一种TaqMan实时荧光定量PCR检测腐生葡萄球菌的方法。

本发明的技术方案如下：

本发明目的在于提供一种检测腐生葡萄球菌的实时荧光定量PCR方法及其引物和探针，以解决现有检测方法操作繁琐、费时费力、成功率低等问题。为了实现本发明的目的，本发明从GenBank数据库，通过使用序列比对工具(Basic local alignment search tool,BLAST)，选取腐生葡萄球菌特有的一段基因(序列号AL528_03090)为目标序列，设计特异性PCR引物和探针，利用TaqMan探针技术建立检测该菌的实时荧光定量PCR方法。

本发明提供用于检测腐生葡萄球菌的TaqMan实时荧光定量PCR引物及探针，所述引物包括：

上游引物Ss3090F：5′-TGACGTATATGGTTTGGG-3′；

下游引物Ss3090R：5′-GTAGGATTTTGCCCAGTA-3′；