[发明专利]检测溶酪大球菌的Taqman实时荧光定量PCR方法

说明书

本发明提供一种TaqMan实时荧光定量PCR检测溶酪大球菌的方法。选取溶酪大球菌的一段特异基因序列(序列号MCCL_RS01590)，基于该特异基因序列，设计PCR引物与TaqMan探针，并建立了检测溶酪大球菌核酸的实时荧光探针定量PCR方法。该方法具有很好的特异性和稳定性，能够满足一般临床样品要求，不会出现假阳性反应。所设计的探针具有极高的敏感性，最低检测限量可达到每个PCR反应检出10个拷贝的目的基因。本发明使用特异基因引物和Taqman探针，在优化的反应条件下检测溶酪大球菌时，具有更高的稳定性、特异性和灵敏性，是一种快速、准确的检测溶酪大球菌的方法。

技术领域

本发明涉及一种Taqman探针荧光定量PCR方法，属于PCR技术领域，尤其涉及一种TaqMan实时荧光定量PCR检测溶酪大球菌的方法。

背景技术

早在1916年，微生物学家伊万斯就发现了溶酪大球菌，不过在当时的技术条件下还无法与葡萄球菌区别，所以就命名为溶酪葡萄球菌。直到1998年，微生物学家Kloos等人，才将其更正命名为溶酪大球菌(Macrococcus Caseolyticus)。该菌属于葡萄球菌科，大球菌属，是革兰氏阳性菌，缺乏磷壁酸，无运动性，无芽孢，具有凝固酶阴性、过氧化氢酶阳性及细胞色素C氧化酶反应阳性等生化特性，其直径是金黄色葡萄球菌的2–4倍。通常溶酪大球菌主要分离自动物皮肤和动物产品，但该菌的进化与人类病原菌金黄色葡萄球菌和炭疽芽胞杆菌密切相关，在适宜的条件下，也会引起机体疾病。同时，研究表明低温肉制品中的溶酪大球菌往往是导致食品腐败变质的主要菌种之一，严重威胁食品安全。

目前，对该菌的检测方法主要是分离培养、常规PCR检测和变性梯度凝胶电泳(DGGE)指纹图谱相结合的方法进行检测。在传统分离鉴定方法中，首先对样品进行平板培养，挑取不同菌落纯化，对各单菌落进行菌落形态和菌体形态观察，并进行生理生化反应等鉴定菌株，判断结果时只靠肉眼观察，没有足够可靠依据，降低实验的准确性。常规PCR及变性梯度凝胶电泳(DGGE)指纹图谱虽然避免了上述方法的缺陷，但存在实验室污染和临床样品中存在PCR抑制物造成假阴性等问题，限制了在快速检测诊断上的推广应用。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明公开了一种检测溶酪大球菌的Taqman实时荧光定量PCR方法，探针法实时荧光PCR技术依据序列特异性探针区别物种，增加了实验特异性和敏感性，提高了结果的准确率，能够很好地解决上述问题，在细菌病原体检测上应用广泛。因此，本发明利用TaqMan探针技术建立了一种灵敏度高、特异性强和稳定性好的快速检测溶酪大球菌的实时荧光定量PCR方法。

本发明的目的是提供一种检测溶酪大球菌的TaqMan实时荧光定量PCR方法。为了实现本发明的目的，本发明选取溶酪大球菌特有的一段基因(序列号MCCL_RS01590)为目标序列，设计特异性PCR引物和探针，利用TaqMan探针技术建立检测该菌的实时荧光定量PCR方法。

本发明提供用于检测溶酪大球菌的TaqMan实时荧光定量PCR引物及探针，所述引物包括：

上游引物Mc1590F：5′-TCCAGGAACATATCGTTA-3′

下游引物Mc1590R：5′-CGCTCTAGATAAGGCTTA-3′

所述探针为：

探针Mc1590T：5′-F-AGGACCCATTCGTCATTATCTGTCT-Q-3′

其中，F为荧光报告基团，Q为荧光淬灭基团。优选地，所述荧光报告基团为FAM，所述荧光淬灭基团为BHQ。

扩增序列为：