[发明专利]一种快速驯化贴壁细胞为全悬浮细胞系的方法

权利要求书

1.一种快速驯化贴壁细胞为全悬浮细胞系的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

1）将低传代健康贴壁细胞直接接种到无血清、无微载体培养基的转瓶中驯化培养；

2）当细胞适应了大于6rpm转瓶机的转速，即细胞密度增长达到1x106细胞/mL后，将细胞转到摇瓶中，用新鲜无血清、无微载体培养基将细胞起始密度调整至5x10⁵细胞/mL，摇瓶转速调整为10-40rpm；

3）如果4-5天后细胞密度增长达不到1x10⁶细胞/mL，将细胞离心沉淀后用新鲜无血清、无微载体培养基将细胞密度调整在5x10⁵ 细胞/mL后继续驯化培养，反复这一驯化步骤直到细胞密度在4-6天后≥10倍增长，即可完成驯化培养；

4）按照上述驯化培养，经过10代以上摇瓶传代驯化培养后，即可获得稳定的全悬浮细胞系。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的无血清、无微载体培养基为加有2mML-谷氨酰胺的MDCK-S细胞无血清培养基。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

1）将低传代健康贴壁细胞接种到含无血清、无微载体培养基的转瓶中，置37℃，5％CO₂的培养箱中培养，转瓶机的速度调整为2-4rpm，细胞起始密度为5 × 10⁵细胞/mL、存活率为95%以上；

2）当培养4-5天后，或细胞密度达到1×10⁶细胞/mL，将部分贴壁细胞消化分散并与培养基中悬浮细胞混合离心沉淀后，再用等量新鲜无血清、无微载体培养基将细胞密度调整到5x10⁵ 细胞/mL后继续转瓶传代培养，转瓶机的速度调整为3-6rpm，其后每传代一次，相应地调高转瓶机的速度1-2 rpm ；

3）当细胞适应了大于6rpm转瓶机的转速后，用等量新鲜无血清、无微载体培养基再将细胞密度调整到5 x10⁵ 细胞/mL并转到摇瓶中驯化培养，将摇瓶置37℃，5％CO₂的培养箱摇床中，摇床的速度调整为10-40rpm，如果4-5天后细胞密度增长达不到1x10⁶细胞/mL，应将细胞离心沉淀后用新鲜无血清、无微载体培养基将细胞密度调整在5x10⁵ 细胞/mL后继续驯化培养，反复这一驯化步骤直到细胞密度在4-6天后≥10倍增长，即可完成驯化培养；

4）按照上述驯化培养，经过10-16代摇瓶传代培养后，即可得到稳定的全悬浮细胞系。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，低传代健康贴壁细胞直接接种到无血清、无微载体培养基的转瓶前，先制成细胞悬液，细胞悬液的制备过程包括如下：

1）选择低传代，健康的贴壁细胞常规培养在玻璃方瓶中，待细胞单层生长至70-80%后，用不含钙离子和镁离子的磷酸盐缓冲溶液 清洗细胞单层后，加胰蛋白酶-EDTA 消化液分散细胞，然后加胰蛋白酶抑制剂溶液终止消化反应，得到细胞悬液；

2）将细胞悬液转移到 15mL 离心管中常规离心，弃上清，重复清洗2次后，再次用不含钙离子和镁离子的磷酸盐缓冲溶液悬浮细胞，根据台盼蓝染色计得细胞数和存活率，将悬浮的细胞稀释至5×10⁵细胞/mL。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的贴壁细胞为贴壁MDCK，CRFK，MDBK，MDOK, ST，PK-15，NBL-6，RK－13,Vero, Marc104 , Marc-145或BHK－21细胞。

6.权利要求1-5任一权利要求所述的全悬浮细胞系对多种病毒敏感，可用于流感病毒，副流感病毒，呼吸道合胞病毒，腺病毒，腺相关病毒，冠状病毒，疱疹类病毒，肠道病毒，包括：猪腺病毒，绵羊腺病毒，猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒，猪流行性腹泻病毒，猪瘟病毒，猪痘病毒，水疮性口炎病毒，猪水泡病毒，杯状病毒，呼肠孤病毒，牛病毒性腹泻病毒，传染性牛鼻气管和羊蓝舌病病毒、狗腺病毒，狗副流感病毒，狂犬病毒，伪狂犬病毒，狗瘟病毒，狗冠状病毒或犬细小病毒疫苗的生产。