[发明专利]一种抗除草剂基因PAR3(G311E)的应用

说明书

本发明属于分子生物学、基因工程技术领域，具体为可提高植物和微生物对除草剂百草枯抗性能力的突变基因PAR3(G311E)及其应用。在拟南芥和酵母中人为地过量表达PAR3(G311E)能够增强宿主对除草剂百草枯的耐受性，使它们在除草剂处理情况下能够存活。具体是在含有百草枯的培养基上，与野生型相比，过表达PAR3(G311E)的转基因株系能够存活长大而非转基因的对照植物则因叶片发黄而枯死；过表达PAR3(G311E)的转基因酵母也比不表达PAR3(G311E)的酵母在百草枯存在的情况下生长状态更好。本发明提供的基因能够增强植物应对除草剂百草枯胁迫的能力，降低农作物在百草枯处理下的产量损失，并且可以作为进行转基因操作时转基因株系的筛选标记，具有实际应用价值。

技术领域

本发明属于分子生物学和基因工程技术领域，具体涉及一种拟南芥基因PAR3(G311E)的应用，还涉及拟南芥基因PAR3(G311E)的克隆、转基因载体构建、转基因、表达检测及表型分析。PAR3(G311E)是PAR3基因的CDS序列第932位脱氧鸟苷酸突变为脱氧腺苷酸，导致PAR3所编码的蛋白质第311位甘氨酸变为谷氨酸所致，突变后的蛋白质被称为PAR3(G311E)。PAR3(G311E)基因可用于提高植物对除草剂百草枯的耐受性，也可作为转基因筛选标记在构建转基因载体时应用。

背景技术

农作物在田间生长，杂草会竞争吸收土壤中的营养和水分，影响作物的生长状态和种子产量，因此耕作者必须耗费大量的时间和人力成本来除去田间滋生的杂草。除草剂发明以后，耕作者在田间除草上花费的人力大大减少。除草剂可以分为选择性除草剂和灭生性除草剂。选择性除草剂对不同种类的植物作用程度不同，它可以杀死部分杂草，而对作物无害。灭生性除草剂则对所有植物都有毒性，一般靶点为植物光合作用系统或者蛋白质合成机器，导致植物死亡，常用的灭生性除草剂有百草枯、草甘膦等。基因工程育种技术诞生以后，灭生性除草剂由于防治杂草种类较为广泛而被广为使用。育种公司通过将抗除草剂基因转入农作物体内，育成抗除草剂作物，在田间种植时只需要定期喷洒除草剂，就可以除去杂草，而作物则因为带有抗性而被保留。除草剂的使用使得作物大规模种植变得方便，不再需要耗费大量人力手工拔除杂草。该技术的瓶颈是寻找可用的抗除草剂基因。寻找抗除草剂基因，并将它们转入作物体内，可育成新的抗除草剂作物。

百草枯（1,1-二甲基-4,4二氯联吡啶化合物，Paraquat，PQ），学名甲基紫精（Methyl Vilogen, MV），是一种使用极其广泛的广谱接触性非选择性除草剂 (Haley,1979)，在光照情况下，它能够接受叶绿体PSⅠ中的电子并传递给分子氧导致体内产生ROS从而造成严重的氧化胁迫 (Bonneh-Barkay et al.,2005)。百草枯已有50多年的使用历史，能够快速杀死与它接触后的一年生和多年生的杂草，并被广泛应用于果园、茶园以及其它农作物种植中，极大促进了农耕业的发展。

我们在筛选拟南芥抗百草枯突变体时，发现一株突变体par3在含百草枯的平板上具有很强的抗性。对突变基因进行定位，发现它是由于PAR3基因突变引起。该基因编码的蛋白属于MATE (multidrug and toxic compound extrusion)家族的成员，分子内第311位甘氨酸突变成为谷氨酸导致了拟南芥对百草枯的抗性。PAR3 定位于液泡膜或者细胞膜上，由483个氨基酸组成，具有12个跨膜结构域，它的突变蛋白PAR3(G311E)的亚细胞定位并未发生改变，但向液泡内或者细胞外转运百草枯的能力增强。在植物或者微生物中人为地增加PAR3(G311E)基因的表达量，可以增强宿主对百草枯的耐受能力。