[发明专利]一种诱导厚叶岩白菜体细胞胚胎的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物学领域，涉及岩白菜属的厚叶岩白菜，是一种诱导厚叶岩白菜体细胞胚胎的方法。

背景技术

厚叶岩白菜(Bergenia crassifolia(L.)Fritsch)为虎耳草科岩白菜属多年生常绿草本，是该属中形体较大种类，国内野生种仅见分布于新疆阿尔泰山，极早春开花，冬季叶片呈紫红色，花叶俱美。全草含有岩白菜素，是治疗呼吸系统疾病的特效药。自然状态下，厚叶岩白菜主要靠分株或籽播繁殖，繁殖率低。野生资源被过度的采挖利用，资源日趋濒危。

发明内容

本发明的目的在于提供一种诱导厚叶岩白菜体细胞胚胎的方法。所述的这种诱导厚叶岩白菜体细胞胚胎的方法要解决现有技术中，厚叶岩白菜繁殖率低的技术问题，并为遗传转化奠定基础。

本发明提供了一种诱导厚叶岩白菜体细胞胚胎的方法，包括如下步骤：

1)诱导愈伤组织：取无菌试管苗形态学上端第二对、第三对叶片，修剪叶片边缘出现伤口，叶片远轴面朝下放于MS+2,4-D 0.1～1.0mg/L+KT 0.01～0.1mg/L+V_C 0.05～1.0mg/L培养基上，黑暗培养，培养25～35天；

2)增殖愈伤组织：剥离诱导出的愈伤组织，转接入增殖培养基MS+ZT 0.5～2.0mg/L+NAA 0.01～0.1mg/L+V_C 0.05～1.0mg/L，黑暗培养，培养25～35天；

3)诱导体细胞胚胎：将愈伤组织转接入诱导培养基MS+ZT 0.1～2.0mg/L+IBA0.01～0.1mg/L+V_C 0.05～1.0mg/L，黑暗培养，培养55～65天，诱导出体细胞胚胎后，再转移至光照下培养。

进一步的，诱导愈伤组织的培养基中，2,4-D浓度可以为0.1～1.0mg/L区间的任一浓度；KT浓度可以为0.01～0.1mg/L区间的任一浓度；V_C浓度可以为0.05～1.0mg/L区间的任一浓度。其中最佳诱导愈伤培养基为MS+2,4-D 1.0mg/L+KT 0.1mg/L+V_C 0.5mg/L，黑暗培养30天。

进一步的，愈伤组织增殖培养基中，ZT浓度可以为0.5～2.0mg/L区间的任一浓度；NAA浓度可以为0.01～0.1mg/L区间的任一浓度；V_C浓度可以为0.05～1.0mg/L区间的任一浓度。其最佳愈伤组织增殖培养基为MS+ZT 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+V_C 0.5mg/L，黑暗培养30天。

进一步的，诱导体细胞胚胎的培养基中，ZT浓度可以为0.1～2.0mg/L区间的任一浓度；IBA浓度可以为0.01～0.1mg/L区间的任一浓度；V_C浓度可以为0.05～1.0mg/L区间的任一浓度。其最佳诱导体细胞胚胎培养基为MS+ZT 1.0mg/L+IBA 0.1mg/L+V_C 0.5mg/L，黑暗培养60天。

进一步的，上述各种培养基，其pH值为5.6～5.9区间的任一数值；蔗糖的质量百分比浓度为2.5％～3.5％区间的任一数值；琼脂的质量百分比浓度为0.55％～0.75％区间的任一数值。

厚叶岩白菜作为用途较广的中药材，需求量不断攀升，形体的大小、生长速度快慢、生态适应性及岩白菜素含量高低是决定其能否推广的几个重要因素。本发明建立了愈伤组织发生途径，首次诱导出了岩白菜属体细胞胚胎，为今后扩繁推广、遗传转化及倍性育种培育新品种奠定基础。

本发明和已有技术相比，技术效果是积极和明显的，并具有独特性、新颖性和创新性。本发明以厚叶岩白菜无菌苗的嫩叶为起始材料，诱导出愈伤组织，进而诱导出体细胞胚胎，分化率最高为26.67％，为遗传转化及倍性育种奠定了基础。

附图说明

图1是厚叶岩白菜愈伤组织的照片。

图2是厚叶岩白菜体细胞胚的照片。

图3是厚叶岩白菜子叶胚的照片。

图4是厚叶岩白菜子叶胚切片。

具体实施方式

下述实施例中的缩略词中英文对照表

下述实施例中每种处理调查30个，统计诱导愈伤组织率、愈伤组织增重倍数、体细胞胚胎诱导率。除特别说明外，每种处理重复3次。