[发明专利]小麦矮腥黑粉菌原生质体的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及细胞工程中真菌原生质体制备与再生技术领域，具体涉及一种小麦矮腥黑粉菌原生质体的制备方法。

背景技术

小麦矮腥黑穗病(wheat dwarf bunt disease，DB)是一种由小麦矮腥黑粉菌(Tilletia controversa Kühn,TCK)引起的检疫性病害，具有危害严重、防治困难等特点，对小麦的生产具有毁灭性破坏。感病植株通常具有矮化多分蘖的症状，穗上的籽粒变成黑粉，是病原菌的冬孢子，冬孢子有鱼腥味，引起小麦产量和品质降低。国内外对于小麦矮腥黑穗病的研究主要集中在病原菌的鉴定、生物学特性以及分子检测技术等，对该病原菌的致病机制研究较少。遗传转化技术是实现大规模定点突变的重要方法，利用该技术能够改变真菌的遗传物质，研究植物病原菌的的致病机理。目前，真菌遗传转化的方法有很多，常见的有聚乙二醇介导的原生质体转化、限制性内切酶介导的整合以及农杆菌转化等。

当前，利用原生质体进行分子转化技术已成为丝状真菌转化、相关分子克隆技术和致病机制研究的重要组成部分，原生质体分子转化技术依赖于制备高效可再生的原生质体，但由于不同种类丝状真菌细胞结构，尤其是细胞壁的结构和组成存在着明显差异，因此制备原生质体的最佳条件和体系也存在着很大差异。国内外尚未见小麦矮腥黑粉菌的原生质体制备体系相关报道，这不利于对该病原菌进行深入的致病分子机制研究。原生质体的高效再生是后期深入研究其致病分子机制的必需条件，不同的酶解时间及稳渗剂对原生质体再生具有重要影响。为了筛选小麦矮腥黑粉菌致病力变异菌株，加强对其致病机制的了解，更好地为农业生产上开展抗病分子育种提供基础，需要对其原生质体制备及再生的方法进行研究。

发明内容

针对上述领域存在的不足和需求，本发明的目的在于提供一种小麦矮腥黑粉菌原生质体的制备方法。

本发明通过如下技术方案实现：

小麦矮腥黑粉菌原生质体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)菌丝培养：在土壤浸提液培养基上培养小麦矮腥黑粉菌冬孢子，待冬孢子萌发后转接到T19液体培养基中振荡培养，在土壤浸提液培养基上培养的天数与在T19液体培养基中振荡培养的天数总共为40～50天，收集菌丝体；

(2)细胞壁裂解：以KCl溶液作为渗透压稳定剂，配制混合酶液，加入到菌丝体中，28℃振荡酶解2～3小时，即得到小麦矮腥黑粉菌原生质体；

所述混合酶液包括质量百分比浓度为1.5％的崩溃酶、1.5％的溶壁酶和1.5％的蜗牛酶。

优选地，所述在土壤浸提液培养基上培养的天数与在T19液体培养基中振荡培养的天数总共为45天。

优选地，所述在土壤浸提液培养基上培养小麦矮腥黑粉菌冬孢子的天数为30～35天，所述转接到T19液体培养基中振荡培养的天数为10～15天。

优选地，所述28℃振荡酶解的时间为2.5小时。

优选地，所述在土壤浸提液培养基上培养小麦矮腥黑粉菌冬孢子的培养条件为温度为5℃和相对湿度为50％；所述转接到T19液体培养基中振荡培养的培养条件为温度为5℃和转速为150rpm。

优选地，所述KCl溶液的浓度为1.2mol/L。

优选地，所述混合酶液与所述菌丝体的配比为20ml：1g。

优选地，所述振荡酶解在180r/min的转速下进行。

优选地，所述土壤浸提液培养基的制备方法为：称取75g灭菌土壤，溶于500ml沸水后，过滤，取滤液，加入20g琼脂粉，然后加水定容至1L，121℃高压蒸汽灭菌。

优选地，所述T19液体培养基的配方为：KH₂PO₄ 613mg/L，MgSO₄·7H₂O 246mg/L，K₂HPO₄·3H₂O 114mg/L，CaCl₂ 55.5mg/L，螯合Fe 20mg/L，ZnSO₄·7H₂O 3.52mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.38mg/L，MnSO₄·H₂O 0.31mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.025mg/L，氯化硫胺素5mg/L，L-天冬酰胺3mg/L，蔗糖20mg/L。