[发明专利]一套基于化脓性链球菌的碱基编辑系统及其在基因编辑中的应用

权利要求书

1.一套基于化脓性链球菌的碱基编辑系统，其特征在于，所述碱基编辑系统由rAPOBEC1:Cas9:UGI和gRNA表达载体两部分组分组成；

所述rAPOBEC1:Cas9:UGI为rAPOBEC1:Cas9:UGI表达载体、rAPOBEC1:Cas9:UGI mRNA或rAPOBEC1:Cas9:UGI蛋白；

所述rAPOBEC1:Cas9:UGI表达载体是通过基因合成和分子克隆的方法将rAPOBEC1:Cas9:UGI的编码基因克隆到pcDNA3.1(-)载体中得到；

所述gRNA表达载体是通过酶切连接的方式将SEQ ID NO.15所示RNA序列克隆到包含T7启动子的pDR274载体中，并将其线性化，然后再以该线性化载体为模板制备得到；

其中，所述rAPOBEC1:Cas9:UGI mRNA是用限制性内切酶切割所述rAPOBEC1:Cas9:UGI表达载体，酶切产物纯化获得转录模板DNA，然后转录生产mRNA；

所述rAPOBEC1:Cas9:UGI表达载体为HF1-BE2表达载体、HF1-BE3表达载体、HF2-BE2表达载体或HF2-BE3表达载体，序列分别如SEQ ID NO.3～6所示；

所述rAPOBEC1:Cas9:UGI mRNA为HF1-BE2 mRNA、HF1-BE3 mRNA、HF2-BE2 mRNA或HF2-BE3 mRNA，序列分别如SEQ ID NO.7～10所示；

所述APOBEC1:Cas9:UGI蛋白为HF1-BE2蛋白、HF1-BE3蛋白、HF2-BE2蛋白或HF2-BE3蛋白，序列分别如SEQ ID NO.11～14所示。

2.根据权利要求1所述基于化脓性链球菌的碱基编辑系统，其特征在于，所述rAPOBEC1:Cas9:UGI蛋白是先通过PCR的方式将rAPOBEC1:Cas9:UGI融合基因克隆到pET28a载体中，然后将其转化到大肠杆菌中表达并纯化获得。

3.根据权利要求1所述基于化脓性链球菌的碱基编辑系统，其特征在于，构建方法如下：

S1.构建rAPOBEC1:Cas9:UGI

S11.制备rAPOBEC1:Cas9:UGI表达载体，为HF1-BE2表达载体、HF1-BE3表达载体、HF2-BE2表达载体或HF2-BE3表达载体，序列分别如SEQ ID NO.3～6所示；

S12.制备化脓性链球菌rAPOBEC1:Cas9:UGI mRNA：以线性化的HF1-BE2表达载体、HF1-BE3表达载体、HF2-BE2表达载体或HF2-BE3的表达载体为模板，转录生产rAPOBEC1:Cas9:UGI mRNA，然后纯化并用不含核酸酶的水洗脱；

S13.制备APOBEC1:Cas9:UGI蛋白：以HF1-BE2表达载体、HF1-BE3表达载体、HF2-BE2表达载体或HF2-BE3表达载体为模板，利用SEQ ID NO.16～17所示mRNA上下游引物进行扩增，然后克隆到用NotI和AscI酶切过的pET28a载体，然后转化到大肠杆菌中，通过诱导表达，层析柱纯化获得rAPOBEC1:Cas9:UGI蛋白；

S2.构建gRNA表达载体

S21.制备化脓性链球菌gRNA的转录载体：将SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的gRNA上游引物和gRNA下游引物退火成双链DNA，同时用BasI酶切pDR274载体，然后将退火产物克隆到该载体中，获得gRNA的转录载体；然后将转录载体用DraI酶切，纯化后用不含核酸酶的水洗脱，获得包含T7启动子的化脓性链球菌gRNA转录模板DNA；

S22.制备化脓性链球菌gRNA：以包含T7启动子的化脓性链球菌gRNA转录模板DNA为模板，转录生产化脓性链球菌gRNA。

4.权利要求1～3任一所述基于化脓性链球菌的碱基编辑系统在制备哺乳动物细胞和/或胚胎的基因编辑试剂中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述基因编辑是指在哺乳动物细胞和/或胚胎中进行单基因敲除、多基因敲除和/或基因突变。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，应用的方法是将rAPOBEC1:Cas9:UGI表达载体、rAPOBEC1:Cas9:UGI mRNA或rAPOBEC1:Cas9:UGI蛋白，以及gRNA导入到哺乳动物细胞或胚胎中。