[发明专利]一种富集BRCA1和BRCA2基因目标区域的引物、方法、试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了一种富集BRCA基因目标区域的引物、方法、试剂盒及其应用，涉及生物技术领域。所述引物具有如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.52所示的序列，是将扩增区段包含BRCA1和BRCA2基因所有外显子和外显子侧翼的内含子区域的一套26对引物优化组合得到的5组引物对；本发明通过这5个引物组将PCR反应数降低到了5个；在对待测样品进行扩增时，利用5组引物对中的每组引物对进行多重PCR扩增所得到的5组的扩增产物中，每组扩增产物的扩增片段之间长度有明显区别，不但使得扩增产物质量易于监控，而且还实现待测样品中的BRCA1和BRCA2基因目标区域的100％富集；将其用于基因序列突变的检测，效率高、准确性好、成本低廉、方法简单。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地涉及一种利用多重PCR富集BRCA1和BRCA2基因区域的引物、方法、试剂盒及其应用。

背景技术

BRCA1和BRCA2是重要的抑癌基因，参与染色体损伤修复过程。BRCA1和BRCA2的突变可能造成基因功能的降低或缺失，进而增加细胞癌变的风险。现有的数据显示，这两个基因的胚系突变是造成遗传性乳腺及卵巢癌的最重要因素，突变携带者一生中罹患乳腺癌的几率可高达87％，卵巢癌的几率可高达44％。因此，对高危人群进行BRCA1/2基因突变检测，对于癌症的预防，发现和治疗有着重要的指导意义。

BRCA1和BRCA2已发现的突变大部分是单个碱基的突变或少量碱基的缺失和插入。这些突变可以造成基因产物氨基酸序列的改变、翻译的提前终止、或信使RNA加工的异常，进而影响蛋白的功能。为了检测这些突变，常规方法是PCR扩增得到感兴趣的基因片段后，以Sanger法进行序列测定。全面扫描两个基因所有编码外显子通常需要进行80个以上的PCR反应，扩增片段通常采用正反双向测序以保证准确性，工作量较大，成本较高。

越来越多的实验室开始采用二代测序技术来检测BRCA1和BRCA2的突变。二代测序技术由于其高通量的特性，可以覆盖更大的基因组区域，并且在一次测序中可以完成多个样本的突变检测。基因组目的区域的富集是这一技术的关键。大型实验室多采用杂交捕获技术或微滴PCR、微流体PCR等技术。这些技术各有其优点，但在成本和仪器要求上均有较高要求。

例如，申请号201610334650.9公开的用于扩增人乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2编码序列的PCR引物，其主要利用引物进行两轮PCR获得，虽然可以得到BRCA1和BRCA2基因突变的检测结果，但是由于其扩增出的基因片段不能完全覆盖到目的基因的全部，即其覆盖率不能达到100％，因此可能存在不能准确检测出每个突变位点的技术问题。

长片段扩增(Long-range PCR)技术操作简单，成本低廉，适应性强，同样也是目前使用较广的目的区域富集技术。现有的应用方式，是使用PrimeStar等适用于长片段扩增的DNA聚合酶，以10kb左右的扩增子大小覆盖BRCA1和BRCA2整个基因组区域，共需要15-20对引物。这种方法每对引物单独扩增，每个样品所需的PCR反应管数较多，不利于大批量操作，由于扩增子存在重合，且扩增长度的设置决定了多重扩增产物中的各个片段无法用简单的方式，如琼脂糖凝胶电泳，进行分析，所以也不适于以多重PCR的方式缩减反应管数。

发明内容

本发明针对现有技术存在的问题，舍弃了部分大跨度内含子的中间区域，设计了一套共26对扩增范围涵盖BRCA1和BRCA2所有外显子，和部分内含子区域，互不重叠长度在2kb至8kb之间，分组同时进行多重PCR，每个片段均能通过普通的琼脂糖凝胶电泳进行区分。

为实现本发明的目的，本发明第一方面提供一种富集BRCA1和BRCA2基因目标区域的引物，包括：

从其扩增区段包含BRCA1和BRCA2基因所有外显子和外显子侧翼的内含子区域的多对引物中得到的五组引物对；