[发明专利]细胞色素P450、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-细胞色素P450还原酶及其应用

说明书

本发明涉及细胞色素P450、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸‑细胞色素P450还原酶及其应用。本发明揭示了一组新的、在萜类化合物羟基化催化及灵芝三萜合成中发挥作用的细胞色素P450(P450 GP01和P450 GP02)，以及与之配合完成羟基化催化的一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸‑细胞色素P450还原酶(GLCPR)。更具体地，本发明的细胞色素P450 GP01能特异和高效地催化四环三萜化合物底物的C‑23位的羟基化；本发明的细胞色素P450 GP02羟基化灵芝酸DM和灵芝酸TR生成多种产物；本发明的GLCPR能够与细胞色素P450配对，协助细胞色素P450发挥羟基化活性。

技术领域

本发明属于生物技术和微生物学领域；更具体地，本发明涉及新型细胞色素P450、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-细胞色素P450还原酶及其应用。

背景技术

灵芝三萜是从灵芝及其同属真菌(如紫芝，树舌等)中分离到的高度氧化的羊毛甾醇衍生物，属于四环三萜类化合物，是灵芝的主要药用成分之一。目前，已经从灵芝中分离出了至少150种三萜类化合物，其中部分灵芝三萜被证实具有广泛的生理功能和潜在的药物价值：包括抗肿瘤、抗病毒、护肝、降胆固醇等效果。

从结构上来看，灵芝三萜是羊毛甾醇经过一系列氧化、还原和乙酰化反应形成的生物活性分子。灵芝三萜依据其C-17位侧链功能基团的不同可以分为灵芝醇、灵芝醛和灵芝酸等。灵芝酸是灵芝三萜的重要组分，灵芝酸依据其母核双键的位置和数目可分为Ⅰ型和Ⅱ型灵芝酸，Ⅰ型灵芝酸在C-8与C-9之间存在一个双键，Ⅱ型灵芝酸在C-7与C-8之间和C-9与C-11之间存在共轭双键。除了母核的差异，灵芝酸之间结构上的差异主要体系在母核C-3、C-7、C-11、C-12、C-15、C-22和C-23不同的取代基修饰，主要包括羟基化、脱氢反应和乙酰基修饰等。

不同的修饰位点和不同的取代基使灵芝三萜具有结构多样性，同时也赋予了灵芝酸不同的生理功能和药用价值。例如，灵芝酸A,C2和DM都是Ⅰ型灵芝酸，灵芝酸A具有抗乳腺癌和保肝作用；灵芝酸C2除了可以抗肿瘤还具有抗炎，抗组织胺和抗衰老等作用；灵芝酸DM不仅可以抗乳腺癌，还具有抗前列腺癌和抑制破骨细胞生成的功能。

细胞色素P450的主要功能是在电子供体NAD(P)H的存在下，将氧气中的一分子氧插入到底物分子中。根据氨基酸序列的相似性，目前细胞色素P450已有700多个家族。目前已测序的真菌基因组中，发现存在百种以上不同的P450。其主要参与生物合成途径和生物解毒途径。细胞色素P450在灵芝三萜的生物合成中起着重要的作用，广泛参与了灵芝三萜的合成，其作用是四环三萜母核C-3、C-7、C-11、C-12、 C-15、C-22和C-23插入一个氧原子，引入一个羟基，从而形成或者进一步通过脱氢和乙酰化修饰形成不同药用价值的灵芝酸。

在真核细胞中，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-细胞色素P450还原酶是一种膜蛋白，在细胞色素P450催化反应体系中起重要的作用。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-细胞色素 P450还原酶负责将电子从电子供体(NADPH)传递给细胞色素P450，为细胞色素 P450羟基化反应提供电子。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-细胞色素P450还原酶属于核黄素蛋白家族，具有与三个辅酶FMN，FAD和NADPH结合的保守结构域。

目前，灵芝和紫芝的基因组和转录组都已经公布，研究人员已经注释了大量的细胞色素P450，还没有P450的功能得到鉴定和阐述，具体哪些P450参与了灵芝酸的合成还未知。由于灵芝中含有数量众多的细胞色素P450，且它们的含量都很低，所以它们的分离纯化的研究进展缓慢。在灵芝和紫芝的基因组中注释了一个烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-细胞色素P450还原酶，其功能也尚未得到鉴定。

灵芝酸7-oxo-ganoderic acid Z是一种Ⅰ型灵芝酸，其在灵芝中的含量占干重的百万分之一左右，是一种乙酰辅酶A还原酶和酰基辅酶A-胆固醇酰基转移酶抑制剂，有望用于降血脂和防止动脉硬化。灵芝酸Jc是一种Ⅱ型灵芝酸，其在灵芝中的含量占干重的千万分之三左右，对人早幼粒白血病细胞具有选择性抑制活性，有望用于治疗或辅助治疗人早幼粒白血病。