[发明专利]结合PD-1受体的非抗体结合蛋白及其应用

说明书

本发明提供一种结合PD‑1受体的非抗体结合蛋白及其应用，该非抗体结合蛋白具有分子量小、可人工合成，安全性高等特点。PD‑1‑nABP284不仅能够跟细胞总蛋白中的PD‑1蛋白结合，而且能够跟活细胞表面的PD‑1蛋白分子结合；同时，还能跟淋巴结组织中PD‑1阳性细胞结合。研究发现PD‑1‑nABP284在小鼠体内会聚集在腹股沟及腋下淋巴结，而淋巴结中T细胞含量较高，说明PD‑1‑nABP284在体内可能倾向于与PD‑1阳性的T细胞结合。实验进一步显示PD‑1‑nABP284能与PD‑L1竞争性结合PD‑1受体，阻断PD‑1/PD‑L1通路，缓解PD‑L1的白介素‑2分泌抑制作用，增进iCIK淋巴细胞的肿瘤杀伤能力，发挥类似于PD‑1单克隆抗体的作用。研究还证明筛选出的PD‑1‑nABP284不影响稳定表达PD‑1的细胞株的增殖，且对细胞株没有毒性，同时在小鼠体内也没有毒性，安全性好。

技术领域

本发明属于医药生物技术领域，具体涉及一种能与PD-1受体结合的非抗体结合蛋白及其 应用。

背景技术

PD-1(细胞程序性死亡受体1)是一个由288个氨基酸组成的I型跨膜糖蛋白，定位于 PDCD1基因，与CD28及CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4)拥有约30％的同源性 序列。PD-1的结构包括胞外段免疫球蛋白可变区(IgV)样结构域、疏水跨膜区及胞内段， 其中胞内段含有免疫受体络氨酸抑制结构域(ITIM)及免疫受体络氨酸转换结构域(ITSM)， 在PD-1抑制性信号通路中发挥重要作用。

PD-1表达于激活的T细胞、B细胞及NK细胞上，参与抑制外周组织中持续的免疫应答， 在防止自身免疫损伤中发挥重要作用。然而，PD-1的持续激活会影响T细胞的活化与增殖， 抑制IL-2等细胞因子的分泌，引起T细胞的衰竭，从而减弱T细胞的肿瘤杀伤能力。

PD-1的激活依赖于与配体PD-L1或PD-L2的结合，两者结合后激活下游信号通路，进而 抑制T细胞的功能。PD-L1和PD-L2高表达于多种肿瘤细胞中，如黑色素瘤、非小细胞肺癌、 乳腺癌及软组织肉瘤等。肿瘤病人的免疫系统处于抑制状态，是因为肿瘤细胞上的PD-L1和 PD-L2表达上调，与T细胞表面的PD-1相互作用，引起T细胞的衰竭，肿瘤细胞从而可以逃避T细胞的攻击。

针对PD-1的单克隆抗体能阻断PD-1/PD-L1的相互作用，从而恢复T细胞的功能，解除 肿瘤病人体内的免疫抑制状态，对如黑色素瘤、非小细胞肺癌等多种肿瘤有较好的疗效。多 项临床实验证明，PD-1治疗性单抗在黑色素瘤、非小细胞肺癌中有显著的疗效，这些肿瘤病 人体内的免疫抑制状态得到改善。

头颈部肿瘤(HNSCC)病人体内的肿瘤细胞PD-L1表达升高，提示其免疫状况与黑色素 瘤病人体内的免疫状态相似，都是处于免疫抑制的状态。HNSCC病人的外周血中CD3+，CD4+ 及CD8+的T细胞比例很低，尽管在手术治疗几年后，仍存在这个现象；头颈部肿瘤复发的 病人外周血中CD4+T细胞比例也非常低，说明免疫系统处于抑制状态。IFN-γ或者外源性 的肿瘤抗原与头颈部肿瘤细胞共孵育后，可以提高细胞毒性T细胞对头颈部肿瘤细胞的识别 杀伤能力，提示免疫治疗可以提高免疫细胞对肿瘤细胞的识别及杀伤，从而达到治疗肿瘤的 效果。手术及化疗后的HNSCC病人接受免疫细胞治疗后，总体生存率明显提高。PD-1治疗 性单抗Pembrolizumab在PD-L1阳性表达的复发性HNSCC病人的临床试验中显示出良好的 疗效。在一项招募173名HNSCC病人的I期临床实验中，总体的客观反应率在23.7％；另一 项临床实验中，60名HNSCC接受Pembrolizumab治疗，总体反应率是18％，且副作用低。以上免疫细胞治疗及PD-1单克隆抗体治疗的临床实验说明，免疫治疗在HNSCC病人中是有效的。

应用患者肿瘤浸润淋巴细胞或外周血淋巴细胞通过体外诱导扩增培养以后回输患者的过 继细胞治疗(Adoptive cell transfer ACT)显著增进了恶性黑色素瘤、恶性淋巴瘤、肾癌、非小 细胞肺癌和头颈部肿瘤的疗效，延长了患者的生存时间。