[发明专利]外异蛋白A基因TNF编码区突变检测的引物组、试剂盒及检测方法

说明书

本发明提供了一种检测外异蛋白A基因TNF编码区核酸序列的特异性引物，以及包含该引物的检测外异蛋白A基因TNF编码区突变的试剂盒，以及检测外异蛋白A基因TNF编码区突变的方法，以及特异性引物和试剂盒在检测外异蛋白A基因TNF编码区突变中的应用。本发明中引物组在合适条件下扩增出的条带单一，无非特异性条带；检测过程简捷，只需经过PCR扩增再测序即可，检测特异性强、灵敏度高，结果准确。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种外异蛋白A基因TNF编码区突变检测的引物组、试剂盒，以及试剂盒的应用。

背景技术

先天性牙发育不全是一种牙齿发育缺陷的遗传性疾病，通常在牙胚形成中恒牙未能发育和形成。它分为非综合征型缺牙(non-syndromic hypodontia，NSH，OMIM号为313500)和综合征型缺牙(syndromic hypodontia，SH，OMIM号为305100)，前者表现为单纯缺牙，后者缺牙并伴随毛发稀少、汗腺少等。先天性牙发育不全会严重影响患者的咀嚼、发音、颜面美观、身心发育及心理健康。

外异蛋白A(ectodysplasin-A，EDA)基因的突变是导致非综合征型缺牙和综合征型缺牙的决定性因素，EDA基因(NM_001399)位于X染色体的长臂上(Xq12-13.1)，有9个外显子，基因大小为425kb，经过拼接产生不同的构型，最长可编码391个氨基酸，称为EDA-A1，属于伴X隐性遗传。EDA蛋白形成三聚体，被弗林蛋白酶(furin)酶切之后分泌到细胞外，与三聚体膜蛋白EDA受体(EDA receptor，EDAR)一对一结合，激活下游相关信号如NFκB等，影响外胚层发育。其中，编码TNF结构域的核酸序列如SEQ ID No.1所示，由外显子7、8、9组成，TNF结构域可以与EDA受体(EDA receptor,EDAR)相互作用。EDA基因TNF编码区的突变会引起EDA蛋白结构变化，进而影响与EDAR相互作用及EDAR下游信号分子的激活，造成不同程度外胚层发育不全。

通过在不同数据库，包括HGMD(http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php)、Uniport(http://www.uniprot.org)和NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中检索EDA、OMIM号313500及305100等统计发现，到目前为止，已报道导致先天性非综合征型缺牙和综合征型缺牙的EDA基因突变已超过200例，突变位点分布于EDA蛋白的各个结构域，但大部分突变位点集中在TNF编码区，在导致氨基酸残基发生改变但没有改变开放阅读框ORF长度的100例错义突变中，共有64例突变发生在TNF编码区，且TNF结构域的不同的位点的突变可以导致不同的缺牙表型，如表1所列出，均为已报道的、可导致缺牙表型的突变。

通过Naccess软件(http://www.bioinf.manchester.ac.uk/naccess/)计算TNF结构域氨基酸的相对溶剂可及性(relative solvent accessibility，RSA)的值发现，导致非综合型缺牙的突变氨基酸位点侧链平均RSA值绝大多数大于8，而导致综合型缺牙的突变氨基酸位点侧链平均RSA值绝大多数小于8。因此，当TNF结构域的氨基酸位点侧链平均RSA值大于8时，突变导致的缺牙表型倾向于非综合型缺牙；而当TNF结构域的氨基酸位点侧链平均RSA值小于8时，突变导致的缺牙表型倾向于综合型缺牙。通过对EDA蛋白TNF结构域所有氨基酸位点进行侧链平均RSA值计算并预测其可能导致的缺牙表型得到表2。

目前还没有一种检测人群样本的外异蛋白A基因TNF编码区突变、并根据基因突变判断表型的方法，因此建立检测外异蛋白A基因TNF编码区突变的方法及检测和预测突变可能导致的表型迫在眉睫。

发明内容

本发明提供了一种检测外异蛋白A基因TNF编码区核酸序列的特异性引物，以及包含该引物的检测外异蛋白A基因TNF编码区突变的试剂盒，以及检测外异蛋白A基因TNF编码区突变的方法，以及特异性引物和试剂盒在检测外异蛋白A基因TNF编码区突变中的应用。