[发明专利]一种高灵敏表达绿色荧光蛋白的逆向神经环路示踪的重组伪狂犬病毒的制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种高灵敏表达绿色荧光蛋白的逆向神经环路示踪的重组伪狂犬病毒的制备方法和应用，包括（1）制备高灵敏表达绿色荧光蛋白的重组伪狂犬病毒；（2）在标记神经环路中的应用，该平台成功制备高灵敏表达绿色荧光蛋白的重组伪狂犬病毒。本发明成功获得高灵敏表达绿色荧光蛋白的逆向神经环路示踪的重组伪狂犬病毒，在神经环路标记、药物筛选平台的建立、药物抑制病毒作用机制、病毒疫苗和诊断试剂的研发、动物模型的建立、病毒复制和致病机制的分析等方面具有广泛的应用价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体涉及一种高灵敏表达绿色荧光蛋白的逆向神经环路示踪的重组伪狂犬病毒的制备方法和应用。

背景技术

人脑是自然界中最为复杂的系统之一,而神经网络是大脑行使功能的基础。神经网络的正常连接，使得人体产生正常的生理活动，如认知、学习、记忆和恐惧等；神经网络的异常往往导致神经疾病的出现，如：阿尔茨海默病、帕金森病、抑郁症等，但是还没有有效的手段来治疗这些神经疾病。目前，正常生理活动和致病机制均不清楚，主要的原因在于脑神经网络连接信息的缺乏。因此，开展脑神经环路的研究而绘制高精度的脑功能连接图谱，对于了解人的生理活动和致病机制具有重要的意义。我国政府高度重视脑科学的研究，《国家中长期科学和技术发展规划》将“脑科学与认知科学”列为八大前沿科学问题之一,有一批科学家已投身于该领域的研究，并取得了一系列的成果。2012年，中国科学院启动了战略性先导科技专项“脑功能联结图谱研究”，并在2014年成立了“脑科学卓越创新中心”。2013年，美国和欧盟已经开始实施人脑图谱研究计划。脑科学研究计划是继人类基因组计划后又一个具有挑战的伟大计划，该计划的研究成果将会和人类基因组计划的成果一样造福人类。性能优良的神经环路示踪工具对于顺利开展该项目具有十分重要的作用。

伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)属于疱疹病毒科α-疱疹病毒亚科成员，基因组为线状双链DNA分子，约150kb，成熟病毒粒子含有约50种蛋白质，PRV除了具有疱疹病毒科成员的优点外，其不感染人，因而成为研究神经环路的重要工具。然而，野生型PRV毒力强，感染大鼠后3天左右即引起死亡，同时具有双向运动的特点，因此，限制了其在神经环路研究中的应用。而由野生型PRV衍生而来的疫苗株(PRV-Bartha)的毒性大大减弱，感染大鼠后10天才引起动物死亡，而且具有严格逆向传播的特点，大大提高了其在神经环路研究中的应用价值。目前为止，研究人员以PRV为对象，构建了一系列的带有荧光蛋白标签的重组PRV，并成功应用于神经网络结构和功能的研究。尽管如此，其表达荧光蛋白的效率较低，因此，建立高敏感度表达绿色荧光蛋白的重组伪狂犬病毒具有十分重要的意义。

随着分子生物学的不断发展，科学家已经能够通过反向遗传学的手段来定向改造病毒，为深入开展相关的病毒学研究提供了良好的工具。因此，本发明分别采用不同的技术途径获得了一种减毒且带有荧光蛋白基因的伪狂犬病毒。将在解析脑神经环路、病毒抗原表位分析和药物(如抗体药物)筛选、疫苗和诊断试剂的研发、动物模型的建立和病毒复制与致病机制的分析等方面具有广泛的应用价值和前景。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种高灵敏表达绿色荧光蛋白(Enhanced GreenFluorescent Protein，EGFP)的逆向神经环路示踪的重组伪狂犬病毒的制备方法。

本发明的另一个目的在于提供了一种高灵敏表达绿色荧光蛋白的逆向神经环路示踪的重组伪狂犬病毒的应用，该重组病毒可应用于脑科学研究和药物筛选和抗原表位分析，也在药物抑制病毒作用机制的分析、疫苗和诊断试剂的研发、动物模型的建立和病毒复制与致病机制的分析等方面具有广泛的应用价值。

为了实现以上目的，本发明采用如下技术方案：

一种高灵敏表达绿色荧光蛋白的逆向神经环路示踪的重组伪狂犬病毒的制备方法，包括下述步骤：