[发明专利]一种HBV pgRNA的实时荧光定量RT-PCR检测引物组、探针组、试剂盒及方法

权利要求书

1.一种用于检测HBV pgRNA的试剂盒，其特征在于：

所述的试剂盒包括检测引物组和检测探针组，还包括酶系；

所述的检测引物组和检测探针组包括：

引物组1和探针组1；

或引物组2和探针组2；

所述的引物组1包括以下4条引物：

引物F1：其核苷酸序列为5’-TGG TGT CTT TTG GAG TGT GGA T-3’；引物R1：其核苷酸序列为5’-CCA CCT TAT GTG TCC AAG GAA TAC T-3’；引物F2：其核苷酸序列为5’-TTC ACCTCA CCA TAC GGC ACT CAG GC-3’；和引物R2：其核苷酸序列为5’-ATG AAT GTC AGG AAAAGA AGG AGT TTG CC-3’(SEQ ID NO：4)；

所述的探针组1包括以下两条探针：

探针P1：其核苷酸序列为5’-CGC ACT CCT CCT GCA TAT AGA CCA TCA AA-3’(SEQ IDNO：5)，其5’端标记有荧光基团，所述的荧光基团为FAM、HEX、VIC、CY5和TET中的一种；其3’端标记有的淬灭基团，所述的淬灭基团为TAMRA、MGB和BHQ中的一种，

和探针P2：5’-TCT CAA TCG CCG CGT CGC A-3’(SEQ ID NO：6)，其5’端标记有荧光基团，所述的荧光基团为FAM、HEX、VIC、CY5和TET中的一种；其3’端标记有的淬灭基团，所述的淬灭基团为TAMRA、MGB和BHQ中的一种；探针P1和探针P2应具有相同的荧光基团；

所述的引物组2包括以下4条引物：

引物F3：其核苷酸序列为5’-TTT GGT GTC TTT TGG AGT GTG GA-3’；引物R3：其核苷酸序列为5’-CTT ATG TGT CCA AGG AAT ACT AA-3’；引物F4：其核苷酸序列为5’-GTT CACCTC ACC ATA CGG CAC TCA GG-3’；和引物R4：其核苷酸序列为5’-TGA ATG TCA GGA AAAGAA GGA GTT TGC CA-3’(SEQ ID NO：10)；

所述的探针组2包括以下两条探针：

探针P3：其核苷酸序列为5’-TTC GCA CTC CTC CTG CAT ATA GAC CAT CA-3’(SEQ IDNO：11)，其5’端标记有荧光基团，所述的荧光基团为FAM、HEX、VIC、CY5和TET中的一种；其3’端标记有的淬灭基团，所述的淬灭基团为TAMRA、MGB和BHQ中的一种，

和探针P4：其核苷酸序列为5’-CTC AAT CGC CGC GTC GCA-3’(SEQ ID NO：12)，其5’端标记有荧光基团，所述的荧光基团为FAM、HEX、VIC、CY5和TET中的一种；其3’端标记有的淬灭基团，所述的淬灭基团为TAMRA、MGB和BHQ中的一种；探针P3和探针P4应具有相同的荧光基团；

所述的酶系包括：(1)Tfl DNA聚合酶；(2)MMLV反转录酶；(3)Stoffel片段。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒还包括反应试剂；所述的反应试剂包括：(1)Tris-硫酸；(2)MOPS缓冲液；(3)柠檬酸钠；(4)(NH4)₂SO₄；(5)MgSO₄；(6)聚氧乙烯月桂醚(Brij-35)；(7)乙酰化BSA。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品；所述的阴性对照品为生理盐水；所述的阳性对照品为采用检测引物组对HBV基因组扩增所获得的扩增片段。

4.一种HBV pgRNA的实时荧光定量RT-PCR检测方法，所述的检测方法包括以下步骤：

(1)病毒RNA的提取；

(2)实时荧光定量RT-PCR反应：

实时荧光定量RT-PCR反应体系为：

RNAase-free ddH₂O补至50μL；

实时荧光定量RT-PCR反应程序为：

第一步：45℃，20～45分钟；94～96℃，2分钟；第二步：94～95℃，15～30秒；65～69℃，30～75秒；68～72℃，30～40秒；6～9个循环；第三步：93～95℃，15～20秒；60℃，30秒；68～72℃，30秒；8个循环；第四步：93～95℃，15秒；52～55℃，30～60秒；40个循环；55℃时收集荧光；

(3)结果判定：

1)阳性：检测样本Ct值小于等于35.0，且曲线有明显的指数增长期；

2)可疑：检测样本Ct值大于35.0且小于40.0，重复一次实验，如果Ct值小于40.0，且曲线有明显的指数增长期，为阳性，否则为阴性；

3)阴性：检测不到样本Ct值或Ct值为40；

所述的酶混合液包括Tfl DNA聚合酶、MMLV反转录酶和Stoffel片段；

所述的PCR Mix包括：48mM的pH8.5的Tris-硫酸、18mM的pH7.9的MOPS缓冲液、3mM的柠檬酸钠、20mM的(NH4)2SO4、7mM的MgSO4、0.10％(W/V)的聚氧乙烯月桂醚、0.1mg/mL的乙酰化BSA、300～800nM的权利要求1所述的试剂盒中的检测引物组、100～300nM的权利要求1所述的试剂盒中的检测探针组、420mM的dNTP。