[发明专利]一种从全血中分选活性有核细胞并精准涂片的方法

说明书

本发明公开了一种从全血中分选活性有核细胞并精准涂片的方法，包括：利用离心装置对全血进行离心，以去除全血中的红细胞；加入荧光试剂以识别全血中去除红细胞所得的活性有核细胞亚群；在流式细胞仪上对识别出的全血中去除红细胞所得的活性有核细胞亚群进行分选；将分选出的活性有核细胞收集到含有缓冲液或培养液的收集装置中，并利用离心涂片机对收集装置进行涂片，以将活性有核细胞涂在与收集装置连接的载玻片上。通过上述方式，本发明所提供的方法能够有效从大容量全血中去除红细胞，并从大容量全血中分离得到活性的有核细胞，并精准将活性的有核细胞特别是单个活性有核细胞涂到载玻片上。

技术领域

本发明涉及生物学和医学技术领域，尤其是涉及一种从全血中分选活性有核细胞并精准涂片的方法。

背景技术

细胞是生命的基本单位，生物体内的每个细胞都是独一无二的，它在生物系统中占据特定的空间位置，具有相对独立的遗传体系和基因表达调控机制。细胞尤其是单细胞分析可了解生物的多样性并用于疾病的精准诊断及指导治疗。

细胞的来源包括组织、脑脊液、胸水、腹水、羊水、血液等。因为外周血采集方便、对机体损害小，检测并获取外周血中的单个有核细胞，在肿瘤的早期诊断和治疗、产前诊断、免疫学研究等领域将有更广泛的应用和实际价值，单个细胞的图像分析是技术手段之一。

外周血由血细胞和血浆组成。血细胞包括无核的红细胞及有核细胞(主要为白细胞)，其中有核细胞占全血细胞的比例仅为千分之一。对单个核细胞亚群，比如外周血中CD4+T细胞，占全血细胞比例低至万分之一；肿瘤患者外周血中的循坏肿瘤细胞(CTC)和孕妇外周血中的胎儿有核红细胞，占有核细胞的比例低至百万分之一，占全血细胞比例只有亿分之一甚至十亿分之一，这意味着得到一个目的细胞需要检测分选大量样本，因此去除红细胞是提高目的细胞获取效率的必要手段。

目前去除全血中红细胞并保持有核细胞活性的一种方法为红细胞裂解法，这种方法中红细胞裂解液与全血样本的体积比为10-20:1，一般仅用于100微升左右全血的制备。1毫升的全血需要10-20毫升的红细胞裂解液，而对全血中含量稀少的细胞的分选，比如CTC和孕妇外周血中胎儿有核红细胞，需要全血5-10毫升，甚至更多，因此，这种方法不适合大容量血样(1ml以上)的处理。

另外一种去除红细胞的方法为Ficoll密度梯度离心法，离心后，红细胞和粒细胞因比重大，沉于分层液之下，单核细胞和淋巴细胞浮在分层液之上。这种方法操作时间长，对细胞损伤大，单核细胞和淋巴细胞在分层液上为一薄层，难以吸取，细胞得率不稳定。

也就是说，上述两种方法均无法有效获取活性有核细胞。

传统识别有核方法采用荧光试剂标记白细胞，然后在流式细胞仪上对白细胞进行检测分群。但单纯荧光试剂染色无法辨别活性有核细胞，影响对活性有核细胞的分选。

流式细胞仪能将复杂样本中活性有核细胞快速精准地直接分选至载玻片上，但含细胞的液滴迅速干燥，形成盐结晶，导致细胞膜破裂，无法看到完整的细胞。又或者在载玻片上滴等渗液体，将活性有核细胞分选到等渗液体中，然后盖上盖玻片使细胞在等渗液体中保存较长时间，但盖玻片覆盖的过程，会造成细胞流失，并且这种情况下，无法对细胞进行染色处理，等渗液体干燥后，同样形成盐结晶，导致细胞破裂。这两种情况均破坏或影响了细胞的形态，无法进行完整的图像分析。

也就是说，现有的各种技术均无法精准地把活性有核细胞放到载玻片上，且容易丢失，不便于后续形态观察。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是提供一种从全血中分选活性有核细胞并精准涂片的方法，解决了现有技术中无法有效获取大容量全血中活性有核细胞并精准涂片的技术问题。