[发明专利]一种裸鼹鼠骨骼肌成肌细胞的分离培养方法

权利要求书

1.一种裸鼹鼠骨骼肌成肌细胞的分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、将裸鼹鼠新生鼠骨骼肌，去掉筋膜、脂肪、皮肤等组织，用预冷的洗涤液冲洗数次后，剪碎备用；所述洗涤液的组成为：PBS溶液，0.5％-2％(V/V)PS双抗，0.005％-0.02％(W/V)Dnase I；

B、加入每克肌肉1mL组织消化液，33-37℃消化30min，5min摇一次；所述组织消化液的组成为：D-Hanks溶液，0.2％(W/V)中性蛋白酶，0.2％(W/V)IV型胶原酶，0.1％(W/V)I型胶原酶，0.1％(W/V)胰酶，0.01％(W/V)Dnase I；

C、移出消化好的细胞悬液，加入与组织消化液相等体积的抑制液终止消化；所述抑制液的组成为：低糖DMEM培养基、5％-15％(V/V)FBS、0.5％-2％(V/V)PS双抗、0.005％-0.02％(W/V)Dnase I；

D、细胞悬液经细胞筛过滤，收取滤液，离心收集细胞，采用培养基重悬细胞，吹打均匀后加入培养皿中，在33-37℃、3-5％CO₂环境中培养0.5-2h后，重复一次；所述培养基的组成为：低糖DMEM培养基、5％-15％(V/V)FBS、0.5％-2％(V/V)PS双抗；

E、取细胞培养液及未贴壁的细胞，加入新的培养皿中，在33-37℃、3-5％CO₂、10-15％O₂的环境中继续培养16-36小时，此后隔天换液一次，直到上层没有悬浮细胞，即得裸鼹鼠骨骼肌成肌细胞。

2.根据权利要求1所述的裸鼹鼠骨骼肌成肌细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤A中，所述洗涤液的组成为：PBS溶液，加入0.01％(W/V)Dnase I、1％(V/V)PS双抗。

3.根据权利要求1所述的裸鼹鼠骨骼肌成肌细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤C中，所述抑制液的组成为：低糖DMEM培养基、10％(V/V)FBS、1％(V/V)PS双抗、0.01％(W/V)Dnase I。

4.根据权利要求1所述的裸鼹鼠骨骼肌成肌细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤D中，所述细胞筛为200目细胞筛。

5.根据权利要求1所述的裸鼹鼠骨骼肌成肌细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤D中，100g离心5min收集细胞。

6.根据权利要求1所述的裸鼹鼠骨骼肌成肌细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤D中，所述培养基的组成为：低糖DMEM培养基、10％(V/V)FBS、1％(V/V)PS双抗。

7.根据权利要求1所述的裸鼹鼠骨骼肌成肌细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤D中，在35℃、5％CO₂的环境中培养40分钟后换液，重复一次。

8.根据权利要求1所述的裸鼹鼠骨骼肌成肌细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤E中，在35℃、5％CO₂、12％O₂的环境中培养24小时，此后隔天换液一次。