[发明专利]一种抗m6A单克隆抗体的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及医学生物工程技术领域，具体地说，是一种抗m6A单克隆抗体的制备方法。

背景技术

人类DNA和蛋白质上存在着丰富的化学修饰，其动态变化发挥着重要的作用，通过参与基因表达调控，决定细胞的状态，影响细胞的分化和发育。最新的研究表明，RNA中的化学修饰与DNA和蛋白质中的化学修饰相似，也在调控个体生命活动中发挥着重要的作用。其中，m6A是真核生物中最常见的RNA转录后修饰形式，也是近年来表观遗传学研究的热点。m6A是发生在碱基A第六位N原子上的甲基化修饰形式，其导致了超过80％的RNA碱基甲基化。越来越多的研究证实，基于m6A修饰的RNA甲基化调控通过调节mRNA 及miRNA的剪接、转运、代谢，参与机体发育、代谢及繁殖的整个过程，并与多种疾病密切相关。目前，人们对RNA甲基化的动态变化的检测及在转录组中的分布研究主要依赖于基于m6A单克隆抗体的ELISA和MeRIP技术，因此，制备具有高特异性、高亲和力的m6A单克隆抗体十分重要。

m6A的分子量小于1000Da，属于仅有反应原性而无免疫原性的半抗原，难以通过常规的动物免疫制备抗体。目前，制备小分子半抗原抗体的一般方法是：通过共价键使半抗原与大分子质量蛋白质载体偶联，制备人工免疫原，经动物免疫程序制备特异性抗体。其中，涉及半抗原的设计，连接臂的引入及活性基团的选择等多个技术环节，工艺复杂。

因此，提供一种简单、易行的适用于m6A的抗体制备方法具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗RNA表观遗传修饰m6A的单克隆抗体的制备方法，用于解决现有技术中通过载体蛋白偶联m6A来制备m6A抗体技术工艺复杂成本高的问题。

本发明的第一方面，提供一种抗m6A单克隆抗体的制备方法，包括：步骤一，活化载体纳米磁珠；步骤二，以所述纳米磁珠为载体，通过与核苷偶联制备免疫原；步骤三，利用所述的免疫原制备m6A抗体；

其中，所述的核苷是m6A，其化学结构如下式所示；

所述的载体纳米磁珠：平均粒径为300-1000nm；表面氨基基团含量在～200μm；磁核为Fe₃O₄。在本发明的优选实施方式中，所述的载体纳米磁珠选自由苏州海狸生物医学工程有限公司生产的NHS磁珠。

所述的步骤一活化载体纳米磁珠的步骤包括：磁珠预处理，充分混匀磁珠后，取100μL磁珠到1mL EP管中，磁吸去除上清液，用200μL PBS溶液洗涤 3次，磁吸去上清；戊二醛活化，加入新鲜配制的质量体积比为15％的戊二醛溶液到EP管中，涡旋混匀，避光反应1h；活化后洗涤，磁珠活化后，磁吸去上清，用PBS缓冲液洗涤3次。

所述的步骤二纳米磁珠与核苷偶联制备免疫原的步骤包括：向装有磁珠的 EP管中加入200μg m6A，轻柔混匀，避光反应3h；将EP管置于磁分离架上磁性分离去除上清液，加入200-1000μL PBS溶液重悬磁珠，反应1h；将EP 管置于雌性分离架上磁性分离去除上清液，用PBS洗涤3次后，重新悬浮于保存溶液中。

所述的步骤三利用所述的免疫原制备m6A抗体的步骤包括：将上述纳米磁珠与核苷偶联物作为免疫原免疫小鼠；获取免疫小鼠的脾细胞，与小鼠骨髓瘤细胞融合；经过多轮筛选获得分泌识别m6A单分子的单克隆抗体的杂交瘤细胞株；通过在小鼠体内接种上述杂交瘤细胞生产腹水抗体，将腹水进行纯化，得到所述的抗m6A单克隆抗体。

本发明的第二方面，提供一种m6A偶联复合物，包括核苷及其偶联的载体纳米磁珠，其中核苷是m6A，其化学结构如下式所示；所述的载体纳米磁珠：平均粒径为300-1000nm；表面氨基基团含量在～200μm；磁核为Fe₃O₄；

所述的m6A偶联复合物的制备方法，包括以下步骤：

a)磁珠预处理，充分混匀磁珠后，取100μL磁珠到1mL EP管中，磁吸去除上清液，用200μL PBS溶液洗涤3次，磁吸去上清；

b)戊二醛活化，加入新鲜配制的戊二醛溶液(15％)到EP管中，涡旋混匀，避光反应1h；

c)活化后洗涤，磁珠活化后，磁吸去上清，用PBS缓冲液洗涤3次；

d)向装有磁珠的EP管中加入200μg m6A，轻柔混匀，避光反应3h；

e)将EP管置于磁分离架上磁性分离去除上清液，加入200-1000μL PBS 溶液重悬磁珠，反应1h；